腺相關病毒包裝服務
腺相關病毒（Adeno-associated virus）屬于細小病毒科，Dependoparvovirus屬，是目前發現的一類結構簡單、無包膜的單鏈DNA缺陷型病毒，它的生命周期依賴于復制病毒的參與，如腺病毒和單純皰疹病毒。野生型的腺相關病毒可以定點整合到人類第19號染色體的AAVS1位點，而重組腺相關病毒由于缺少整合和復制必需的兩個基因而無法整合。因此，重組腺相關病毒主要以游離于染色體的附加體形式存在，并可長時間存在于非分裂細胞中。另外，腺相關病毒具有高組織特異性、良好的擴散性、低免疫原性、高安全性和穩定性。基于以上特點，重組腺相關病毒已經成為科研和基因治療中具市場前景的病毒載體之一。
維真生物擁有十余年病毒包裝經驗，服務全球客戶數千家，依托成熟穩定的AAV病毒包裝平臺和嚴格的生產質控，可為客戶提供基因過表達、基因干擾、基因敲除等定制AAV包裝服務，公司現有的萬余種基因模板可供客戶免費包裝使用，大大縮短服務周期！
根據客戶的個性化實驗需求，維真生物提供優質的腺相關病毒包裝服務。下面是具體服務內容(具體規格、費用、貨期請詳詢客服)：
| 服務編號 | 服務類型 | 規格 | 目錄價 | 貨期 |
|---|---|---|---|---|
| WZ070001 | 小包裝 | 滴度≥1×10E13 vg/ml；體積100ul | 詢價 | 詳詢 |
| WZ070002 | 大包裝 | 滴度≥1×10E13 vg/ml；體積500ul | 詢價 | 詳詢 |
*如您對上述服務感興趣，請您點擊“歡迎垂詢”留下您的信息，我們將為您提供具體實驗方案和項目價格。
現貨產品： AAV對照 工具AAV AAV病毒包裝載體 AAV表達載體 AAV-PCSK9 AAV-SNCA
相關服務： 分子克隆 shRNA克隆 定點突變 AAV血清型篩選服務 AAV中和抗體檢測服務
專題服務： 光遺傳 化學遺傳 鈣指示劑 神經遞質探針 Cre Tet-on 細胞自噬 CircRNA
技術資料： AAV的制備和使用 AAV組織靶向策略 客戶文章 四種病毒的區別
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↓↓ 分以下幾個部分做詳細介紹 ↓↓ |
腺相關病毒的直徑在20-26nm范圍內，其直徑為腺病毒的1/5，慢病毒的1/4，呈現20面體結構，對分裂細胞和非分裂細胞均可感染。
腺相關病毒含有約4.7kb的單鏈線性DNA基因組。基因組兩端為末端反向重復序列(ITR)，對于病毒的復制和包裝具有重要作用；中間基因組編碼兩類蛋白Rep和Cap，Rep蛋白參與病毒的復制和整合，Cap蛋白為病毒衣殼蛋白。衣殼包含三種類型的亞基VP1、VP2和VP3，比例為1:1:10(VP1:VP2:VP3)。基于AAV的基因組結構，基因工程化的AAV載體刪除了全部AAV蛋白編碼序列，添加了外源基因的表達盒。唯一的病毒來源序列是ITR，它們是在病毒包裝過程中指導AAV復制和包裝所必需的。病毒編碼序列的完全去除使AAV的包裝能力最大化，并且有助于它們在體內遞送時的低免疫原性和細胞毒性。
現階段研究人員已發現12種人類AAV 血清型（AAV1至AAV12）和 100多種非人類靈長動物AAV血清型。不同AAV血清型具有不同的衣殼蛋白空間結構、序列和組織特異性，因而其識別與結合的細胞表面受體也相應有很大差別，這也導致不同血清型轉染的組織類型、細胞類型和感染效率也各不相同。表一是人類AAV1至AAV9識別的細胞表面受體；表二是AAV1至AAV9的不同組織親噬性。
| Serotype | Glycan recognitiona | Coreceptor |
|---|---|---|
| AAV1 | Neu5Aca2-3GalNAcβ1-4GlcNAc | Unknown |
| AAV2 | 2-O-and N-sulfated heparin |
Fibroblast / hepatocyte growth factor receptor; laminin receptor; integrin αVβ5 and α5β1 |
| AAV3 | 2-O-and N-sulfated heparin | Hepatocyte growth factor receptor; Laminin receptor |
| AAV4 | Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-6Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc | Unknown |
| AAV5 | Neu5Acα2-3(6S)Galβ1-4GlcNAc | Platelet-derived growth factor receptor |
| AAV6 | Neu5Acα2-3GalNAcβ1-4GlcNAc; N-sulfated heparin | Epidermal growth factor receptor |
| AAV7 | Unknown | Unknown |
| AAV8 | Unknown | Laminin receptor |
| AAV9 | Galactose | Laminin receptor |
| Tissue | Optimal Serotype |
|---|---|
| CNS | AAV1，AAV2，AAV4，AAV5，AAV8，AAV9 |
| Heart | AAV1，AAV8，AAV9 |
| Kidney | AAV2 |
| Liver | AAV7，AAV8，AAV9 |
| Lung | AAV4，AAV5，AAV6，AAV9 |
| Pancreas | AAV8 |
| Photoreceptor Cells | AAV2，AAV5，AAV8 |
| RPE(Retinal Pigment Epithelium) | AAV1，AAV2，AAV4，AAV5，AAV8 |
| Skeletal Muscle | AAV1，AAV6，AAV7，AAV8，AAV9 |
AAV轉導細胞的過程起始于識別細胞表面糖基化修飾的受體，由網格蛋白介導的細胞內吞觸發AAV內化入細胞胞漿，進入內體。AAV在細胞骨架蛋白網絡的幫助下由細胞胞漿向細胞核運輸。在內體的酸性環境下，AAV的衣殼蛋白構象發生變化。AAV逃離內體后或者由蛋白酶體進行蛋白降解，或者入核和脫衣殼，雙鏈轉化，進而形成環形附加體游離于細胞核。下圖是AAV轉導細胞的過程。
目前，研究人員常用的兩類AAV分別為single-stranded AAV (ssAAV) and self-complementary AAV (scAAV)。scAAV是基于2個基礎被開發的：一個是理論基礎：無論scAAV還是rAAV，病毒顆粒中均可包裹二倍體，甚至四倍體的AAV基因組DNA，一個是結構基礎：wtAAV ITR序列的特殊性(T型結構，見AAV基因組部分)。ssAAV包裝基因組正義鏈和反義鏈的幾率一樣。ssAAV在入核、脫衣殼后，需要借助宿主DNA聚合酶或者分子間退火完成雙鏈轉化，才能啟動基因轉錄過程，而scAAV中已存在雙鏈，它入核后即可啟動基因轉錄，跨過了雙鏈轉化的步驟，從而實現外源基因的快速表達。下圖是ssAAV和scAAV向靶細胞中遞送外源基因的過程。
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維真生物采用的腺相關病毒/AAV包裝系統為改良版的腺相關病毒/AAV無輔助病毒系統（AAV Helper-Free System），下面是該包裝系統的示意圖：
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維真生物可以提供從腺相關病毒/AAV質粒設計、構建、包裝至表達分析的全套服務。不僅如此，維真生物也可以提供全面的腺相關病毒/AAV載體和表達系統，用于體內和體外表達human/mouse/rat ORFs，lncRNA、circRNA、shRNAs和CRISPR/gRNA。維真生物生產的腺相關病毒/AAV具有滴度高、純度高和穩定性高的三高優點。下面是腺相關病毒/AAV從頭合成的流程：
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維真生物采用碘克沙醇密度梯度超速離心法對AAV病毒進行純化。碘克沙醇是一種造影劑，已接受了臨床檢驗。它具有非離子型、對細胞無毒和代謝惰性等優點。現在在病毒純化方面應用廣泛。它利用不同顆粒之間存在的沉降系數差，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區域上形成區帶。下圖是AAV病毒純化前后的示意圖：
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維真生物的AAV病毒是通過用QPCR的方法來檢測的病毒滴度，得到的結果為包裝得到的病毒顆粒數。其原理是用腺相關病毒基因組特異性引物進行實時定量PCR。在定量曲線的線性范圍內，Ct值與已知拷貝數質粒的Ct值的比值即為病毒基因組的初始拷貝數。下面是AAV-GFP滴度的檢測結果：
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維真生物的AAV純度通過靈敏的銀染方法進行檢測。AAV衣殼蛋白含有3種亞基VP1（82kDa）、VP2（72kDa）、VP3（62kDa），且所占比例為VP1：VP2：VP3=1:1:10。因此，一個純度高的AAV在SDS-PAGE分析時僅顯示三條帶。下圖是純化后AAVs的銀染結果：
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1. 載體全： |
近30多種組織特異性啟動子和多種報告基因可供客戶選擇。 |
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2. 貨期短： |
AAV克隆載體均與我們18,000個預制人源ORF cDNA克隆MCS區通用，行業中生產周期短； |
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3. 滴度高： |
可提供1012V.G/ml及以上滴度的病毒.可高達1014V.G/ml； |
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4. 服務優： |
可根據客戶具體實驗，由公司專業技術人員提供載體構建方案，提供特殊定制服務。 |
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（點擊下載）
1. AAV 和重組rAAV的區別？
腺相關病毒（AAV）屬于微小病毒科，是一類小的、二十面體、無包膜病毒。1965年，AAV發現于腺病毒制備物中，并由此得名。AAV是一種復制缺陷性病毒，其復制依賴于其他輔助病毒，如腺病毒和皰疹病毒。AAV不編碼自己的聚合酶，因此其復制過程依賴于宿主細胞的聚合酶活性。
重組AAV（rAAV）是人工改造的AAV，沒有編碼AAV病毒復制和結構蛋白的rep和cap基因。rAAV中與復制和包裝相關的rep和cap 基因被替換為ITRs間的基因表達框，這使rAAV具有約4.7 kb的包裝容量。
2. 使用AAV有哪些生物安全性要求 ?
可在生物安全1級（BSL-1）實驗室操作生產無輔助病毒和編碼非致癌基因的重組AAV。另外，應在生物安全2級（BSL-2）實驗室封閉處理具有生物危害性的材料。
3. 重組AAV 安全嗎 ?
迄今為止，未發現野生型AAV有致病性。野生型AAV，在無需輔助病毒（如腺病毒）的存在下，復制效率非常低。重組腺相關病毒（rAAV）由多個質粒（cis質粒、輔助質粒、rep/Cap質粒）組成。Cis質粒、輔助質粒與rep/Cap質粒之間不具有同源性序列，因此重組AAV在理論上不具有復制的能力。
4. 哪些血清型的AAV可供選擇？
目前為您提供的AAV 血清型為AAV1，AAV2，AAV5，AAV6，AAV7，AAV8 &，AAV9，AAV rh10，AAV retro，AAV ANC80，AAV DJ & AAV DJ-8，AAV PhpB & AAV PhpeB，AAV 7m8和AAV shh10等。
5. 使用重組腺相關病毒rAAV遞送基因的優勢是什么 ?
rAAV病毒滴度高，可感染分裂和非分裂細胞、免疫原性小、體內表達外源基因時間長。
6. AAV載體穩定嗎? 如何保存AAV載體 ?
純化的AAV載體在4℃或更低溫度下高度穩定。建議您將AAV分裝后，-80℃下長期保存。
7. 訂制AAV服務，客戶需要提供哪些材料? 客戶收到的產品是怎樣的 ?
您可以從我們的人源ORF cDNA庫中挑選，或者提供您的質粒DNA或DNA序列，我們將基因克隆至AAV載體。您還可以指定特定的融合標簽和AAV血清型。
基因沉默服務，請您提供已驗證的shRNA序列以構建重組rAAV載體。我們的標準載體具有U6啟動子和GFP標記。
通常情況下，可為客戶提供500 ul病毒液1×10^13 VP/ml。也可根據客戶的需要，提供特定規格的產品。
8. 慢病毒、腺病毒、腺相關病毒三種病毒有什么區別？如何選擇？
對于轉染困難的細胞，科研工作者通常會選擇病毒來導入目的基因。目前，腺病毒、慢病毒和腺相關病毒是常用的病毒載體工具。那么如何選擇適合您實驗體系的病毒工具，請參考下面3種病毒工具的比較：
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病毒表達系統 |
腺病毒 |
腺相關病毒 |
慢病毒 |
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病毒基因組 |
dsDNA |
ssDNA |
ssRNA |
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病毒外殼 |
無 |
無 |
具有包膜蛋白 |
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基因組大小 |
38-39kb |
5kb |
9kb |
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包裝容量 |
7.5kb |
4.7kb |
6kb |
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感染的細胞類型 |
分裂細胞和非分裂細胞 |
分裂細胞和非分裂細胞 |
分裂細胞和非分裂細胞 |
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整合至宿主基因組 |
非整合 |
非整合 |
整合 |
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表達豐度 |
高水平表達 |
高水平表達 |
中到高水平表達 |
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表達時間 |
快（1-2天） |
1-2周（體內） |
慢（2-4天） |
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外源基因持續表達時間 |
短暫 |
潛在的持久 |
長久 |
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免疫反應 |
較高 |
極低 |
低 |
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相對病毒滴度 |
10E10pfu/mL |
10E13VG/mL |
10E8TU/mL |
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生物安全等級 |
BSL-2 |
BSL-2 |
BSL-2 |
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神經方面：
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1. |
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2. |
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3. |
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4. |
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5. |
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6. |
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7. |
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8. |
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9. |
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10. |
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11. |
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12. |
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13. |
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14. |
心臟方面：
血管方面：
肝臟方面：
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1. |
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2. |
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3. |
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4. |
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5. |
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6. |
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7. |
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8. |
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9. |
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10. |
皮膚方面：
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1. |
腎臟方面：
|
1. |
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2. |
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3. |
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4. |
肺臟方面：
|
1. |
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2. |
體外實驗：
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1. |
巨噬細胞方面：
|
1. |
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2. |
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3. |
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4. |
CAR-T細胞：
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1. |
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