久久久国产精品无码一区二区三|亚洲欧美日韩国产另类综合|无码国模国产在线观看免费91|日韩国产在线激情不卡二区|欧洲中文字母久久-星影控站

關于『細胞自噬』，你了解多少？

1.細胞自噬簡(jian)介

細胞自噬（autophagy=self-eating）意為自體吞噬，是真核細胞在細胞自噬相關基因（autophagy related gene，Atg）的調控下利用溶酶體降解自身細胞質蛋白和受損細胞器的過程。細胞自噬可防止細胞損傷，促進細胞在營養缺乏的情況下存活，并對細胞毒性刺激作出反應。細胞自噬包括生理條件下的基礎型細胞自噬和應激條件下的誘導型細胞自噬。前者是細胞的自我保護機制，有益于細胞的生長發育，保護細胞防止代謝應激和氧化損傷，對維持細胞內穩態以及細胞產物的合成、降解和循環再利用具有重要作用；但細胞自噬過度可能導致代謝應激、降解細胞成分，甚至引起細胞死亡等。研究表明，細胞自噬能在細胞穩態、衰老、免疫、腫瘤發生及神經退行性疾病等多種生理病理過程中發揮重要作用。
根據包裹物質及運送方式的不同可將細胞自噬分為3種類型（圖1）：

① 巨細胞自(zi)噬（macroautophagy）：通(tong)過(guo)形成具有(you)雙層膜(mo)結構的(de)細(xi)胞(bao)自噬(shi)(shi)(shi)體（autophagosome）包裹胞(bao)內物(wu)質，最終細(xi)胞(bao)自噬(shi)(shi)(shi)體與(yu)溶酶體融合。一般情況下(xia)所說的(de)細(xi)胞(bao)自噬(shi)(shi)(shi)是(shi)指巨細(xi)胞(bao)自噬(shi)(shi)(shi)。

② 微細胞自噬(shi)（microautophagy）：通(tong)過溶酶體或液泡表面的(de)形變直接吞沒特定的(de)細胞(bao)器。

③ 分子伴侶介導的細胞自噬（chaperone-mediated autophagy, CMA）：具有KEFRQ樣(yang)基序的(de)蛋(dan)白在HSP70伴侶的(de)幫助下(xia)，通過LAMP-2A轉運體轉運到(dao)溶酶體。

圖1. 3種細胞自噬途徑 (Duraes Fernanda V et al. Front Immunol, 2015)

2.細胞自噬的(de)發生(sheng)過程

細(xi)胞(bao)自噬是一種在(zai)進化上保守的(de)細(xi)胞(bao)內分解代(dai)謝(xie)過(guo)程(cheng)(cheng)，在(zai)該過(guo)程(cheng)(cheng)中，細(xi)胞(bao)質大分子、聚集(ji)性蛋白、受損細(xi)胞(bao)器或病(bing)原(yuan)體(ti)被運送至溶(rong)酶(mei)(mei)體(ti)，并被溶(rong)酶(mei)(mei)體(ti)水解酶(mei)(mei)降解，產生(sheng)核苷酸(suan)(suan)、氨(an)基酸(suan)(suan)、脂肪(fang)酸(suan)(suan)、糖和三磷(lin)酸(suan)(suan)腺苷，最終再循環到胞(bao)漿中。諸(zhu)如饑餓(e)、輻射、缺氧、細(xi)菌入侵、生(sheng)長因子匱(kui)乏等多種因素均可誘導(dao)細(xi)胞(bao)自噬發生(sheng)。
細胞(bao)自噬(shi)的發生過程大體分為以下4個階段（圖2）：
①細胞(bao)自噬(shi)的起始 在細胞自噬誘(you)導信號的調控下，ULK1復(fu)合物和多種ATG蛋白被(bei)活化，并定位于前細胞自噬體(ti)處。
②隔離(li)膜和細胞自噬體的形成(cheng) ATG蛋白(bai)和脂質不(bu)斷(duan)被募集，從而形成(cheng)杯狀的(de)雙層膜(mo)結構（隔(ge)(ge)離膜(mo)，phagophore）；隨著隔(ge)(ge)離膜(mo)的(de)逐漸延伸，將要被降解的(de)胞漿成(cheng)分完全包裹，最終形成(cheng)閉(bi)合的(de)細胞自噬體（autophagosome）。
③細胞自噬體與溶酶體融合 細胞(bao)自(zi)噬體形成后將(jiang)其包(bao)裹(guo)物通過胞(bao)內運(yun)輸系統運(yun)輸至溶酶體，并與(yu)溶酶體融合。
④細胞自噬體的裂解 細胞自(zi)噬(shi)體(ti)與溶酶(mei)體(ti)融合(he)后形成細胞自(zi)噬(shi)溶酶(mei)體(ti)（autolysosome），最終在溶酶(mei)體(ti)水解酶(mei)的作(zuo)用(yong)下(xia)降解其包裹物。
總(zong)而言(yan)之，細胞(bao)(bao)(bao)自(zi)噬(shi)(shi)的本質其實是細胞(bao)(bao)(bao)內的膜(mo)重排(pai)。在膜(mo)重排(pai)的過程中，會形成一個具有雙(shuang)層膜(mo)并裹挾著隨機或特定底物(wu)的封閉囊泡，即細胞(bao)(bao)(bao)自(zi)噬(shi)(shi)體，進而與溶酶(mei)體融(rong)合，形成細胞(bao)(bao)(bao)自(zi)噬(shi)(shi)溶酶(mei)體并降解底物(wu)。

圖2. 細胞自噬的發生過程 （Li et al. Molecular Cancer，2020）

3.細(xi)胞自噬相關(guan)蛋白

細胞自噬的發生與營養狀態、能量狀態、氧化應激、缺血缺氧等相關，其受多重機制調節，如ULK1通路、Beclin1通路、AMPK通路等。在細胞自噬的發生過程中，有多種細胞自噬相關蛋白可調節和控制細胞自噬形成的不同階段。
如圖2所示，在細胞自噬的發生過程中，多種細胞自噬相關基因調控細胞自噬流的不同階段。迄今為止，科學家已在酵母中鑒定出40余個編碼ATG蛋白的基因，并且大多數在酵母和哺乳動物之間高度保守。在哺乳動物細胞中，饑餓誘導的細胞自噬大約受20種核心ATG基因調節，它們在液泡附近被不斷募集，并組裝形成細胞自噬前體。這些基因的分類和作用（表1）如下：
①ULK1激酶核心復合物(wu) 包括ULK1/2、ATG13、RB1CC1/FIP200和 ATG101；
②PI3K復合物(wu) 包括VPS34、VPS15、Beclin1和ATG14L；
③ATG9A轉運系統 包括ATG9A、WIPI1/2和ATG2A；
④ATG12泛素樣結合(he)系統 包括ATG12、ATG7、ATG10、ATG5和ATG16L1；
⑤LC3泛素樣結合系統 包括LC3A/B/C、ATG7、ATG3和(he)ATG4A/B/C/D。

表1. 細胞自噬(shi)相關基因及其在(zai)細胞自噬(shi)中的蛋(dan)白質功能
（Li et al. Molecular Cancer，2020）

4.細胞自噬的調(diao)控

細胞基礎水平的細胞自噬活性很低，不適于觀察，因此，對細胞自噬研究多需人工干預。
雷帕霉素靶蛋白（mTOR）激酶在細胞自噬反應中起著重要的調節作用。mTOR（Akt and MAPK signaling）在被mTOR激酶激活后，細胞自噬反應被抑制；而在mTOR（AMPK and p53 signaling）被抑制后，細胞自噬反應機制啟動。細胞自噬相關基因（autophagy related gene，Atg）通過形成Atg12-Atg5 和 LC3-II (Atg8-II)復合物來調控細胞自噬體的形成。
細(xi)胞(bao)自(zi)(zi)噬(shi)既能抑(yi)制(zhi)也能促進細(xi)胞(bao)凋(diao)亡(wang)(wang)(wang)，兩種反(fan)(fan)(fan)應在(zai)(zai)生物體(ti)內廣泛(fan)存(cun)在(zai)(zai)。在(zai)(zai)營養缺(que)乏(fa)時，細(xi)胞(bao)自(zi)(zi)噬(shi)反(fan)(fan)(fan)應作(zuo)為(wei)一個細(xi)胞(bao)的(de)促活反(fan)(fan)(fan)應機制(zhi)存(cun)在(zai)(zai)，但(dan)是過量(liang)的(de)細(xi)胞(bao)自(zi)(zi)噬(shi)反(fan)(fan)(fan)應也會導(dao)致細(xi)胞(bao)死亡(wang)(wang)(wang)，但(dan)由細(xi)胞(bao)自(zi)(zi)噬(shi)導(dao)致的(de)細(xi)胞(bao)死亡(wang)(wang)(wang)與細(xi)胞(bao)凋(diao)亡(wang)(wang)(wang)在(zai)(zai)形(xing)態(tai)學(xue)上有明顯的(de)不同。幾(ji)種促凋(diao)亡(wang)(wang)(wang)信號因子，如(ru)TNF、TRAIL和 FADD也會誘導(dao)細(xi)胞(bao)自(zi)(zi)噬(shi)的(de)反(fan)(fan)(fan)應發生。此外，Bcl-2也是細(xi)胞(bao)自(zi)(zi)噬(shi)反(fan)(fan)(fan)應重(zhong)要(yao)的(de)調節因子，其(qi)為(wei)凋(diao)亡(wang)(wang)(wang)抑(yi)制(zhi)蛋(dan)白，通過與Beclin-1結合形(xing)成復合物，來抑(yi)制(zhi)由Beclin-1誘導(dao)的(de)細(xi)胞(bao)自(zi)(zi)噬(shi)。

已(yi)報道的部分干預藥物(wu)詳見表(biao)2：

表2. 細(xi)胞自噬激(ji)動(dong)劑和拮抗劑

目前常用(yong)的(de)細(xi)(xi)胞(bao)自噬激(ji)動(dong)劑(ji)有Rapamycin，EBSS等，常用(yong)的(de)細(xi)(xi)胞(bao)自噬抑(yi)制劑(ji)有Chloroquine，3-MA，NH4Cl和 Bafilomycin A1等。這些細(xi)(xi)胞(bao)自噬激(ji)動(dong)劑(ji)和抑(yi)制劑(ji)可以(yi)分別激(ji)活(huo)/抑(yi)制細(xi)(xi)胞(bao)自噬發生(sheng)的(de)不同(tong)階段，因此研究者可以(yi)根據實(shi)驗需要選擇合適的(de)激(ji)動(dong)劑(ji)或抑(yi)制劑(ji)。更(geng)多(duo)細(xi)(xi)胞(bao)自噬通路(lu)調控藥物見圖3。

圖3.細胞自(zi)噬(shi)通路調控藥物

（Lorenzo Galluzi et al. Nat Rev Drug Discov, 2017 ）

5.細胞(bao)自(zi)噬檢測方(fang)法

在(zai)(zai)生理條件下，細胞(bao)(bao)(bao)(bao)自(zi)噬(shi)活性(xing)通常較(jiao)低。但在(zai)(zai)饑餓(e)、缺氧和疾病(bing)等(deng)刺激下細胞(bao)(bao)(bao)(bao)自(zi)噬(shi)活性(xing)會顯著上(shang)調。另(ling)外，細胞(bao)(bao)(bao)(bao)自(zi)噬(shi)抑制也(ye)與某些(xie)疾病(bing)相關，如(ru)癌癥、神經(jing)退(tui)行性(xing)疾病(bing)和傳染(ran)病(bing)等(deng)。鑒于細胞(bao)(bao)(bao)(bao)自(zi)噬(shi)與不同的生理和病(bing)理生理過(guo)程之間存在(zai)(zai)緊密(mi)聯系，故科學工(gong)作者(zhe)需要(yao)選擇(ze)理想(xiang)的細胞(bao)(bao)(bao)(bao)自(zi)噬(shi)檢測方法。細胞(bao)(bao)(bao)(bao)經(jing)細胞(bao)(bao)(bao)(bao)自(zi)噬(shi)誘(you)導或(huo)抑制后，常用(yong)的觀(guan)察和檢測方法有∶

5.1 透射電鏡(jing)法

細(xi)胞(bao)自(zi)噬體(ti)屬于亞細(xi)胞(bao)結構(gou)，普通光鏡(jing)下(xia)(xia)看不(bu)到，直接在(zai)透射電(dian)鏡(jing)下(xia)(xia)觀察細(xi)胞(bao)自(zi)噬不(bu)同階段的形(xing)態(tai)變化是一種非常直接的方法。細(xi)胞(bao)自(zi)噬各階段的形(xing)態(tai)學特征(zheng)見(jian)表3；透射電(dian)鏡(jing)下(xia)(xia)細(xi)胞(bao)自(zi)噬小體(ti)和細(xi)胞(bao)自(zi)噬溶酶體(ti)的形(xing)態(tai)見(jian)圖4。

表(biao)3. 細胞自噬各階段(duan)特征(zheng)

圖4. 透射電鏡下細胞自噬小體（單箭頭）和細胞自噬溶酶體（雙箭頭）形態
（Noboru, Mizushima et al. Cell, 2010）

5.2 熒光(guang)顯微鏡觀(guan)察法(fa)

LC3（light chain 3）全稱MAP1LC3 (microtubule-associated proteins light chain 3)，貫穿整個細胞自噬過程，是目前公認的細胞自噬標記物。哺乳動物中的LC3與酵母中的細胞自噬相關蛋白Apg8/Aut7/Atg8具有同源性。哺乳動物的LC3可分為三種：LC3A、LC3B和LC3C。其中，LC3B應用最為廣泛。
LC3蛋白合成(cheng)后在(zai)其(qi)羧基端被(bei)Atg4剪切(qie)掉C端5肽(tai)，暴露甘氨酸殘基，產生細(xi)胞(bao)漿(jiang)定位的LC3-I。在(zai)細(xi)胞(bao)自(zi)(zi)(zi)(zi)噬(shi)(shi)過(guo)程(cheng)中，LC3-I會被(bei)包括(kuo)Atg7和(he)Atg3在(zai)內(nei)(nei)的泛(fan)素樣體系修飾和(he)加工，與磷脂(zhi)酰乙醇胺（PE）相偶聯，形成(cheng)LC3-II并(bing)定位于細(xi)胞(bao)自(zi)(zi)(zi)(zi)噬(shi)(shi)體內(nei)(nei)外膜(mo)上。細(xi)胞(bao)自(zi)(zi)(zi)(zi)噬(shi)(shi)體和(he)溶酶(mei)體融(rong)合后，外膜(mo)上的LC3-II被(bei)Atg4切(qie)割，產生LC3-I循環利用；內(nei)(nei)膜(mo)上的LC3-II被(bei)溶酶(mei)體酶(mei)降解，導致(zhi)細(xi)胞(bao)自(zi)(zi)(zi)(zi)噬(shi)(shi)溶酶(mei)體中LC3含(han)量很(hen)低（圖5）。因此，科研工作者可以通過(guo)熒光顯微鏡觀(guan)察(cha)內(nei)(nei)源性(xing)LC3或(huo)GFP-LC3，即可實現對細(xi)胞(bao)自(zi)(zi)(zi)(zi)噬(shi)(shi)發生的檢測。

圖5. LC3在細胞自噬發生中的路徑
(Kiriyama, Y et al. International Electronic Conference on Medicinal Chemistry，2016)

GFP-LC3單(dan)熒光(guang)和mCherry-GFP-LC3雙熒光(guang)指示(shi)系(xi)統
細(xi)(xi)胞自(zi)(zi)噬(shi)形(xing)成時，GFP-LC3或mCherry-GFP-LC3融合蛋(dan)白轉移至(zhi)細(xi)(xi)胞自(zi)(zi)噬(shi)體膜，在熒光(guang)(guang)顯微(wei)鏡下形(xing)成多個明亮(liang)的(de)綠色(se)或黃色(se)熒光(guang)(guang)斑(ban)點。當細(xi)(xi)胞自(zi)(zi)噬(shi)溶(rong)酶體形(xing)成后，酸性的(de)溶(rong)酶體環境使GFP熒光(guang)(guang)淬(cui)滅，而mCherry熒光(guang)(guang)不受影響，細(xi)(xi)胞自(zi)(zi)噬(shi)溶(rong)酶體呈(cheng)現紅色(se)熒光(guang)(guang)（圖6）。因此，科研工作者可以通過LC3熒光(guang)(guang)指示系統來(lai)監測細(xi)(xi)胞自(zi)(zi)噬(shi)流。

圖6. LC3細胞自噬雙標系統追蹤細胞自噬流不同階段
（Hansen T E, Johansen T. BMC Biology, 2011）

5.3 Western Blot檢測LC3和p62蛋白的(de)表達量

① 利用Western Blot檢測LC3-II/I比(bi)值的(de)(de)變化以(yi)評價細胞(bao)自噬形成(cheng)（圖7）。細胞(bao)自噬形成(cheng)時，胞(bao)漿型(xing)LC3-I會酶解掉(diao)一小(xiao)(xiao)段多(duo)肽(tai)，隨后跟PE結合轉變為膜型(xing)的(de)(de)LC3-II。因(yin)此可(ke)以(yi)通(tong)過LC3-II/I比(bi)值的(de)(de)大(da)小(xiao)(xiao)估(gu)計細胞(bao)自噬水平的(de)(de)高低。

② 除LC3外，其他細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)自(zi)噬(shi)底(di)物(wu)表(biao)達量(liang)的(de)(de)變化(hua)也可(ke)以(yi)(yi)用(yong)于(yu)監測(ce)(ce)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)自(zi)噬(shi)流。其中，p62是(shi)研究(jiu)廣(guang)泛(fan)(fan)的(de)(de)一(yi)個細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)自(zi)噬(shi)底(di)物(wu)。p62（也稱為SQSTM1蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)），由以(yi)(yi)下三(san)個結(jie)構(gou)域(yu)(yu)(yu)組成：N端Phox和Bem1 (PB1)結(jie)構(gou)域(yu)(yu)(yu)、鋅(xin)指結(jie)構(gou)域(yu)(yu)(yu)和C端泛(fan)(fan)素相關(UBA)結(jie)構(gou)域(yu)(yu)(yu)。研究(jiu)表(biao)明(ming)，p62蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)鋅(xin)指結(jie)構(gou)域(yu)(yu)(yu)和UBA結(jie)構(gou)域(yu)(yu)(yu)之間(jian)(jian)的(de)(de)連接區域(yu)(yu)(yu)（LRS區域(yu)(yu)(yu)）負(fu)責與(yu)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)自(zi)噬(shi)受(shou)體(ti)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai) Atg8/LC3結(jie)合(he)，UBA結(jie)構(gou)域(yu)(yu)(yu)負(fu)責招募(mu)泛(fan)(fan)素化(hua)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)。在細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)自(zi)噬(shi)體(ti)形成過程中，p62作為鏈接LC3和聚泛(fan)(fan)素化(hua)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)之間(jian)(jian)的(de)(de)橋梁，被選擇性地(di)包裹(guo)進(jin)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)自(zi)噬(shi)體(ti)，之后被細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)自(zi)噬(shi)溶酶體(ti)中的(de)(de)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)水解酶將其降(jiang)解（圖(tu)(tu)8），所以(yi)(yi)p62蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)的(de)(de)表(biao)達量(liang)與(yu)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)自(zi)噬(shi)活性呈現負(fu)相關。因此(ci)，利用(yong)Western Blot檢測(ce)(ce)p62蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)的(de)(de)表(biao)達量(liang)也可(ke)以(yi)(yi)用(yong)來評價細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)自(zi)噬(shi)水平(ping)（圖(tu)(tu)7）。

圖8. p62介導的選擇性細胞自噬模型
（Ichimura Y et al. J Biol Chem, 2008）

5.4 基于Keima蛋白的細胞自噬(shi)評價

Keima是一種PH敏感型的(de)熒(ying)光蛋(dan)白，其雙峰激(ji)發光譜依賴(lai)(lai)于周圍的(de)pH值(zhi)，在(zai)中性和(he)(he)酸性環境中分(fen)別在(zai)440 nm和(he)(he)586 nm處激(ji)活(huo)。Keima在(zai)中性和(he)(he)酸性pH中熒(ying)光信(xin)號不同的(de)特性，可以直(zhi)觀地反(fan)映(ying)細(xi)(xi)胞(bao)自(zi)噬(shi)(shi)程度。將(jiang)細(xi)(xi)胞(bao)質的(de)Keima傳(chuan)遞到溶酶體(ti)可反(fan)映(ying)非選擇性細(xi)(xi)胞(bao)自(zi)噬(shi)(shi)，將(jiang)Keima融(rong)合到特定的(de)蛋(dan)白(如融(rong)合到線粒(li)體(ti)靶向序列—mt-Keima，作為線粒(li)體(ti)細(xi)(xi)胞(bao)自(zi)噬(shi)(shi)標記)可用于反(fan)映(ying)選擇性細(xi)(xi)胞(bao)自(zi)噬(shi)(shi)。值(zhi)得注(zhu)意(yi)是，基于keima的(de)檢測不能在(zai)固定細(xi)(xi)胞(bao)中進行(xing)，因為這種檢測完全(quan)依賴(lai)(lai)于溶酶體(ti)的(de)酸性。

6.維(wei)真細胞自噬相關(guan)產品

維真生物可(ke)提供細(xi)胞(bao)自(zi)噬(shi)研(yan)究(jiu)相關工(gong)具，包含大(da)量(liang)細(xi)胞(bao)自(zi)噬(shi)相關基因的(de)現貨克隆(long)，shRNA克隆(long)，CRISPR克隆(long)，以及(ji)LC3細(xi)胞(bao)自(zi)噬(shi)單雙標克隆(long)和病毒，多種(zhong)策略、多種(zhong)規格、部(bu)分(fen)現貨，滿足您多樣化(hua)的(de)研(yan)究(jiu)需(xu)求。

6.1 病毒產品(pin)

細胞自(zi)噬單(dan)雙標病(bing)毒

注(zhu)：啟動子(zi)為CMV

圖10. 維真(zhen)細胞自噬雙標病毒載體(ti)圖譜

6.2 克(ke)隆(long)產品

部(bu)分細胞自噬(shi)相關基因(yin)

附：維真細胞自噬雙標系(xi)統感染誘導(dao)細胞自噬的HEK293細胞效果圖(tu)

7.客(ke)戶代表(biao)性文章（部分）