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分裂篩選標記慢病毒系統

背景介紹

在科研和細胞工程等領域中構建穩定表達細胞株，經常需要實現多個基因的穩定共表達，目前常用的策略是多重感染、多重分離篩選等，然而這種方式存在很多弊端：①真核細胞中可使用的篩選標記數量有限；②實驗周期長；③同時使用(yong)多(duo)個不(bu)同的篩(shai)選(xuan)基因(yin)可能(neng)對細胞(bao)產生不(bu)利(li)影響；④多(duo)基因(yin)串聯，病毒包裝效(xiao)率低等；以上問題為篩選多基因共表達的穩轉(zhuan)株在時間和成本等方面提出了挑戰。因此，有必要開發新的技術手段解決以上問題。

維真生物建立了一種可(ke)簡單快速地實現多基(ji)因共表達的分裂(lie)篩選系統(tong)！

將一(yi)(yi)(yi)種(zhong)篩選(xuan)(xuan)標(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)分(fen)(fen)成(cheng)N端(duan)(duan)(duan)和(he)C端(duan)(duan)(duan)兩(liang)(liang)部(bu)分(fen)(fen)，分(fen)(fen)別(bie)連接(jie)內(nei)含子(zi)剪(jian)接(jie)接(jie)頭TS1和(he)TS2，構建到兩(liang)(liang)個(ge)(ge)慢病(bing)毒載(zai)(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)中，然后將兩(liang)(liang)個(ge)(ge)載(zai)(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)進行(xing)細(xi)(xi)胞(bao)轉導，部(bu)分(fen)(fen)細(xi)(xi)胞(bao)在此過(guo)程(cheng)中“一(yi)(yi)(yi)無(wu)所獲(huo)”，部(bu)分(fen)(fen)細(xi)(xi)胞(bao)會(hui)“攝(she)取(qu)”其(qi)中一(yi)(yi)(yi)種(zhong)載(zai)(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)，部(bu)分(fen)(fen)細(xi)(xi)胞(bao)會(hui)“攝(she)取(qu)”兩(liang)(liang)種(zhong)載(zai)(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)。只有(you)當含有(you)N端(duan)(duan)(duan)和(he)C端(duan)(duan)(duan)篩選(xuan)(xuan)標(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)的(de)兩(liang)(liang)個(ge)(ge)載(zai)(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)同時被一(yi)(yi)(yi)個(ge)(ge)細(xi)(xi)胞(bao)“攝(she)取(qu)”時，在mRNA水平N-篩選(xuan)(xuan)標(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)和(he)C-篩選(xuan)(xuan)標(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)才會(hui)連接(jie)成(cheng)一(yi)(yi)(yi)個(ge)(ge)完(wan)整(zheng)(zheng)的(de)篩選(xuan)(xuan)標(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)，從(cong)而(er)表達(da)完(wan)整(zheng)(zheng)的(de)篩選(xuan)(xuan)標(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)蛋(dan)白。而(er)那些沒(mei)有(you)“攝(she)取(qu)”到載(zai)(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)，或者只“攝(she)取(qu)”到一(yi)(yi)(yi)種(zhong)載(zai)(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)的(de)細(xi)(xi)胞(bao)（即(ji)N端(duan)(duan)(duan)和(he)C端(duan)(duan)(duan)篩選(xuan)(xuan)標(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)的(de)兩(liang)(liang)個(ge)(ge)載(zai)(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)沒(mei)有(you)進入一(yi)(yi)(yi)個(ge)(ge)細(xi)(xi)胞(bao)），該細(xi)(xi)胞(bao)內(nei)由于(yu)無(wu)法表達(da)一(yi)(yi)(yi)個(ge)(ge)完(wan)整(zheng)(zheng)的(de)篩選(xuan)(xuan)標(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)蛋(dan)白，從(cong)而(er)被淘汰。

圖(tu)1. 分裂篩選標(biao)記原理示意圖(tu)

研發路(lu)線

雙載體圖(tu)譜(pu)

圖2. 慢病毒(du)雙載體圖譜

誘導(dao)性(xing)多(duo)能干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)（IPS cells）是(shi)指(zhi)通過基(ji)(ji)因(yin)轉(zhuan)染技(ji)術(shu)（gene transfection）將某些(xie)轉(zhuan)錄因(yin)子(zi)導(dao)入(ru)動物或人的體(ti)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)，將終末分(fen)化(hua)的體(ti)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)重編程為(wei)胚胎干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)（ESC）細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)樣的多(duo)潛能細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)。現(xian)在(zai)大多(duo)是(shi)通過病(bing)毒攜帶特定的轉(zhuan)錄因(yin)子(zi)進入(ru)體(ti)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)內，來(lai)獲(huo)得多(duo)能性(xing)干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)。2006年日本京(jing)都大學Shinya Yamanaka在(zai)世界(jie)著名學術(shu)雜志《細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)》上率先(xian)報道了誘導(dao)多(duo)能干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)的研究，他們把Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4這(zhe)四種轉(zhuan)錄因(yin)子(zi)基(ji)(ji)因(yin)克(ke)隆入(ru)病(bing)毒載(zai)體(ti)，然后引入(ru)小鼠成纖維細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)，發現(xian)可誘導(dao)其發生轉(zhuan)化(hua)，產生的iPS細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)在(zai)形態、基(ji)(ji)因(yin)和蛋白(bai)表達(da)、表觀遺傳(chuan)修飾(shi)狀態、細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)倍增能力(li)、類胚體(ti)和畸形瘤生成能力(li)、分(fen)化(hua)能力(li)等方面都與胚胎干(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)相似。

然而，目(mu)前研究(jiu)人(ren)員用來(lai)產生(sheng)誘(you)導(dao)性(xing)多能(neng)干細(xi)(xi)胞的方法耗(hao)時長(chang)且效率低(di)，當把四(si)種轉錄(lu)因子(zi)導(dao)入成體細(xi)(xi)胞如(ru)皮膚細(xi)(xi)胞中(zhong)時，利(li)用上千個皮膚細(xi)(xi)胞最終只能(neng)獲(huo)(huo)得幾(ji)個iPSCs。因此，我(wo)們嘗試利(li)用新建(jian)立的分裂篩(shai)選標記的慢病毒(du)穩轉系(xi)統同時表(biao)達(da)以(yi)上四(si)種轉錄(lu)因子(zi)，在短(duan)時間內(nei)獲(huo)(huo)得穩轉細(xi)(xi)胞系(xi)。

首(shou)先，我們將四(si)種(zhong)轉(zhuan)錄(lu)因子分成兩組分別構建到(dao)前(qian)面所(suo)述的雙慢病毒(du)載體中，得(de)到(dao)pLent-Ef1a-Oct4-P2A-Sox2-cmv-N-Puro（簡稱IPS-N-Puro）和pLent-Ef1a-Klf4-P2A-Myc-cmv-C-Puro（簡稱IPS-C-Puro）的慢病(bing)毒質(zhi)粒(li)。隨(sui)后將這兩(liang)個慢病(bing)毒質(zhi)粒(li)共(gong)轉到293A細胞中，通(tong)過Puro篩(shai)選，觀察細胞生長情況。如下圖所示設(she)置(zhi)實驗組與(yu)對照(zhao)組，我們發現在(zai)Puro加壓后(hou)空細(xi)胞(bao)(bao)組細(xi)胞(bao)(bao)大(da)量死亡，而實驗組與(yu)對照(zhao)組中細(xi)胞(bao)(bao)存活率較高。這一結果說明，有大(da)量(liang)的雙慢(man)病毒載(zai)體進(jin)入(ru)了同一(yi)細胞中，抗生素基因(yin)得(de)到了正常表達(da)，大(da)量(liang)細胞得(de)以存活(huo)下來。

隨后，我們對實驗組與對照組細胞中四種轉錄因子mRNA水平的表達情況進行了定量檢測，如下圖所示，我們發現實驗組細胞中四種轉錄因子的mRNA表達量都要明顯高于GFP對照組，這一結果同樣佐證了上述結論，有大量的雙慢病毒載體進入了同一細胞中，四種轉錄因子實現了高表達。

接著，我們將上述兩個慢病毒載體分別包裝成慢病毒，進行293A細胞的共感染，如下圖所示設置實驗組和對照組，感染72小時后，加Puro進行篩選，我們發現，空白組細胞（5）和單一慢病毒感染組（2、3）的細胞，出現大量死亡，而“攝取”到雙病毒的實驗組（1）和GFP組（4），細胞存活率明顯高于兩病毒單獨感染組，在篩選一周后我們成功獲得了大量穩轉株細胞。

同樣地，我們對兩病毒共感染組與GFP慢病毒對照組中細胞中的四種轉錄因子mRNA水平的表達情況進行了定量檢測，結果與質粒轉染所得結果基本一致，兩病毒共感染組細胞中四種轉錄因子的mRNA表達量都要明顯高于GFP對照組，結果同樣驗證了上述結論，四基因共表達的穩轉株細胞構建成功。

維(wei)真(zhen)生物成(cheng)功建立(li)了一種可實現分裂(lie)篩選標記的慢病毒穩(wen)轉(zhuan)系統，能(neng)夠利用(yong)一個篩選標記選擇(ze)多(duo)(duo)個(ge)轉(zhuan)(zhuan)基(ji)因(yin)(yin)(yin)，使多(duo)(duo)基(ji)因(yin)(yin)(yin)的共同(tong)表達(da)更加(jia)簡單方(fang)便，并且能在短(duan)時間(jian)內進行多(duo)(duo)基(ji)因(yin)(yin)(yin)的穩(wen)轉(zhuan)(zhuan)細(xi)(xi)胞(bao)系構建。目前，我們已經利用該系統(tong)成(cheng)功獲得了四種轉(zhuan)(zhuan)錄因(yin)(yin)(yin)子穩(wen)定(ding)表達(da)的誘導性多(duo)(duo)能干細(xi)(xi)胞(bao)的穩(wen)轉(zhuan)(zhuan)細(xi)(xi)胞(bao)株。此外，該系統(tong)還可以在CRISPR/Cas9基(ji)因(yin)(yin)(yin)組編輯中，用于(yu)雙轉(zhuan)(zhuan)基(ji)因(yin)(yin)(yin)或雙等位基(ji)因(yin)(yin)(yin)敲除(chu)的陽(yang)性細(xi)(xi)胞(bao)選擇(ze)。