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人體器官的功能會隨著年齡的增長而逐漸衰退，腦也不例外。腦衰老會產生涉及分子、細胞和功能水平的特征性神經生理變化，了解這些變化及其分子機制對于研究腦衰老及其相關性疾病具有重要的意義。腦衰老的生物學機理十分復雜，與遺傳、年齡和環境等多個因素有關，其中隨年齡和環境等因素而變化的表觀遺傳調控被認為是重要的調節因素之一。
已有研究報道哺乳動物腦中存在大量的環狀RNA（CircRNA）。同時，最近的研究也表明，circRNAs可能作為一種新的調控網絡參與大腦的發育、成熟和衰老。但是，大腦中大多數circRNAs的表達模式和功能尚不清楚，尤其是靈長類動物腦中。非人靈長類動物由于其在遺傳和生理特征上與人類具有相似性，因此，已成為人類疾病建模和治療策略研究的最有價值的模型之一。
2018年，為了研究circRNA在哺乳動物，尤其是靈長類動物大腦中的表達特點和調控作用，中國科學院昆明動物研究所李家立團隊以獼猴的腦組織為實驗材料進行了系統的circRNA表達特點及功能的研究，相關研究成果發表在《Cell Discovery》，題為“Annotation and functional clustering of circRNA expression in rhesus macaque brain during aging”，文章揭示了circRNA的表達在獼猴大腦中呈現組織特異性、性別特異性和年齡特異性，并且circRNA與其宿主mRNA之間存在正相關或負相關調控關系。
2020年7月，中國科學院昆明動物研究所李家立團隊又在《Nature Communications》（IF=12.121）上發表了題為“CircGRIA1 shows an age-related increase in male macaque brain and regulates synaptic plasticity and synaptogenesis”的研究論文，文章在上述研究工作基礎上發現CircGRIA1的表達在獼猴前額葉皮層和海馬區具有年齡特異性和雄性特異性，并且順式作用于Gria1基因啟動子進而調控Gria1基因的表達；體內外操縱circGRIA1表達能夠負調節Gria1基因的表達，敲低circGRIA1可顯著改善老年雄性獼猴海馬神經元的突觸可塑性及突觸再生。該論文強調了CircRNA調控的重要性，加深了人類對腦衰老生物學的了解。
CircGRIA1是由谷氨酸受體AMPA亞基Gria1基因外顯子4，5，6形成的進化保守性circRNA。作者通過qPCR及Northern blot發現CircGRIA1在雄性獼猴腦中呈現增齡性表達升高，且與宿主（Gria1）mRNA表達呈負相關。（圖1）
為了進一步驗證CircGRIA1與其宿主(Gria1)mRNA之間的負調控關系，作者又用BASEscope ISH和RNAscope ISH技術進行了進一步驗證，發現雄性獼猴CircGRIA1的表達在前額葉皮層（PFC）和海馬的CA1& DG區呈現隨年齡增長而上升的趨勢；而其宿主(Gria1)mRNA的表達水平則相反。（圖2）
為了探討CircGRIA1與其宿主(Gria1)mRNA表達負相關的分子機制，作者從體內外用ChIRP技術研究了與CircGRIA1反向剪接點共沉淀的片段，發現CircGRIA1結合其宿主(Gria1)mRNA的5’UTR，進而發揮負調控功能。（圖3）
作者使用慢病毒載體(MOI=5-10)感染DIV5的胎猴海馬神經元，體外操縱CircGRIA1，通過BASEscope ISH和RNAscope ISH技術檢測CircGRIA1和其宿主(Gria1)mRNA的表達，發現DIV28，siRNA感染組的CircGRIA1表達顯著降低；而其宿主(Gria1)mRNA的表達水平則升高。（圖4）
接下來，作者探討了CircGRIA1和Gria1表達負相關的生理功能，如是否參與了老化過程中突觸形成前后的調控。首先，作者將AAV9-siRNAs(CircGRIA1)&AAV9-siRNAs(control)病毒顆粒微注射至10年齡和20年齡雄性和雌性獼猴的海馬區，6周后，采用BASEscope ISH、RNAscope ISH和RT-qPCR檢測CircGRIA1和Gria1的表達水平，發現20年齡雄性獼猴海馬中CircGRIA1表達顯著降低，而Gria1 mRNA表達升高。（圖5）
接著，作者從體內外檢測了獼猴腦中幾個突觸組分表達的年齡相關性變化。免疫組織化學結果(見圖6)顯示，與10年齡雄性和雌性獼猴相比，20年齡雄性和雌性獼猴PFC和海馬CA1 & DG區的synapsin-I(突觸前囊泡蛋白)和PSD95（突觸后膜骨架蛋白）表達水平均顯著降低；敲低CircGRIA1顯著增加了20年齡雄性獼猴海馬中synapsin-I的表達水平，而PSD95表達水平幾乎沒有變化。CircGRIA1敲低組的體外結果跟體內結果一致。
突觸可塑性與谷氨酸受體AMPA和NMDA 介導的神經活動相關。微型自發的興奮性突觸后電流(mEPSCs)用于模擬該神經活動。作者探究了CircGRIA1是否參與突觸可塑性。作者使用慢病毒載體(MOI=5-10)感染DIV5的胎猴海馬神經元，體外操縱CircGRIA1，跟蹤記錄不同時間點的mEPSCs。結果顯示DIV28，control組mEPSCs的振幅和頻率均下降，siRNA感染組則緩解了這種下降。
本研究工作表明CircGRIA1的表達在老年雄性獼猴腦中表達升高。它主要定位于細胞核，其與Gria1基因啟動子區域相結合，以順式作用方式負調控Gria1的mRNA和蛋白水平。體內外敲減CircGRIA1可顯著改善老年雄性獼猴海馬神經元的突觸可塑性及突觸再生。這些研究為進一步認識和理解靈長類動物復雜的大腦結構和功能，尋找參與腦衰老進程的調控因子提供了新證據，為探索衰老相關神經疾病的機理和干預措施提供了參考。
原文鏈接：.
本研究工作表明CircGRIA1的表達在老年雄性獼猴腦中表達升高。它主要定位于細胞核，其與Gria1基因啟動子區域相結合，以順式作用方式負調控Gria1的mRNA和蛋白水平。體內外敲減CircGRIA1可顯著改善老年雄性獼猴海馬神經元的突觸可塑性及突觸再生。這些研究為進一步認識和理解靈長類動物復雜的大腦結構和功能，尋找參與腦衰老進程的調控因子提供了新證據，為探索衰老相關神經疾病的機理和干預措施提供了參考。
| AAV病毒 | AAV9-shRNA(circGRIA1) & AAV9- shRNA(control) |
| 注射動物 | Three-paired 10- and 20-year-old male and female rhesus macaques weighing 6–10 kg |
| 病毒用量 | 單側海馬5次, 20μL/次 (total 100 μL) , titer ~3 × 1014v.g./mL；對側海馬注射等量對照病毒 |
| 注射方式 | 腦立體定位注射，31-gauge漢密爾頓注射器， rate of 500 nL/min |
| 注射位置 | 海馬，見圖8 |
| 檢測時間 | 6周后 |
維真生物科研團隊已成功構建了大量circRNA表達載體，并建立了腺病毒、慢病毒和AAV全套circRNA過表達和干擾載體系統。
| 維真生物circRNA過表達及干擾載體 | |
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| 腺病毒載體 | |
| OE（過表達） | KD（敲低） |
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| 慢病毒載體 | |
| OE（過表達） | KD（敲低） |
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| 腺相關病毒載體 | |
| OE（過表達） | KD（敲低） |
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| 欲知更多circRNA相關載體，請撥打技術熱線電話：400-077-2566 | |
| 維真生物circRNA專題往期回顧 |
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| 『CircRNA領域新發現』浙江大學范順武教授課題組發現CircRNA :CircSERPINE2,為骨關節炎治療提供有效策略 |
| 環狀RNA（CircRNA）與相關服務項目簡介 |
