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慢病毒（Lentivirus）是一類改造自人免疫缺陷I型病毒的病毒載體，是逆轉錄病毒的一種，基因組是單鏈RNA。區別于腺病毒和腺相關病毒，慢病毒能夠介導外源基因整合至宿主基因組，實現基因長時間穩定表達，是體內外基因傳遞的有效工具。
那什么情況下可以選用慢病毒載體呢？ 這就需要根據實驗目的和慢病毒的特點來進行選擇：
1. 如果需要感染的目的細胞是一些難轉染的細胞（如原代細胞、干細胞、不分化的細胞）或者是對腺病毒感染具有較強免疫反應的細胞（如樹突狀細胞、單核細胞和間充質干細胞）時，可以選擇慢病毒載體，能大大提高目的基因轉導效率及整合至宿主基因組幾率。
2. 慢病毒的宿主范圍廣泛，既能感染分裂細胞，也能感染非分裂細胞，所以體內外研究中均可以選用慢病毒作為病毒載體。如果需要構建活體動物模型，尤其是動物成瘤實驗，慢病毒是很好的選擇。
3. 當需要將外源基因整合到宿主染色體上，實現目的基因穩定、長期的表達時，或者后續需要構建穩轉株，那么慢病毒則是理想選擇。
4. 慢病毒載體也可以改造T細胞用于CAR-T細胞治療和基因治療。與其他病毒載體相比，慢病毒生產成本相對較低，而且整合模式致癌風險較低，因此用慢病毒載體生產CAR-T細胞更加經濟且安全有效。
慢病毒既可以感染分裂細胞與非分裂細胞，還能將外源基因整合到宿主染色體上，從而實現長期穩定的表達，是體內和體外基因傳遞的有效工具。然而慢病毒感染效率受到多種因素的影響，今天就一起分析一下影響慢病毒感染效率的因素：
首先，考慮病毒包裝制備是否存在問題，比如外源基因是否正確，病毒滴度是否合格等。其次，考慮病毒運輸和保存方式是否得當，解凍病毒一定要在冰上進行，盡量避免反復凍融，否則會影響病毒滴度；分裝的病毒-4℃可以保存3天，-80℃保存半年以上需要重新測定滴度。
細胞良好的生長狀態是達到高感染效率的保證，一般選擇細胞形態較好、輪廓清晰、處于對數生長期的細胞進行感染可提高感染效率。
理論上MOI值越大，慢病毒感染上的可能性也越大，感染效率越高，但對細胞的毒性也越大（需要的MOI值越大，表明目的細胞越難被感染，慢病毒對細胞的毒性也越大）。所以實驗中可以通過預實驗確定合適的MOI值來達到相對較高的細胞存活率和病毒感染率。
慢病毒一般在感染后24h換液。感染后換液太早會導致感染效率下降;感染后換液太晚，則對細胞的損傷太大，效率也不高（如果慢病毒對細胞有明顯毒性，可根據細胞生長狀態在4-24h后換液）。由于慢病毒的表達較慢，熒光表達所需時間較長，可在感染72~96h后觀察熒光的表達。
MOI（multiplicity of infection），即感染復數，指的是感染時病毒與細胞數量的比值。一般認為MOI是一個比值，沒有單位。合適的MOI值是高感染效率的關鍵因素之一，那么如何確定合適的MOI值呢？
1. 查閱相關文獻，推薦查閱與目的細胞的種類、細胞狀態、實驗條件相似的有參考性的文獻，對MOI值的適宜范圍有基本的了解。
2. 進行預實驗，因慢病毒種類、實驗條件、細胞狀態、實驗人員熟練程度等的不同，文獻報道的MOI值也只能作為參考，推薦正式實驗前在目的細胞中進行預實驗（如梯度實驗）來摸索合適的MOI值。
3. 選取預實驗中細胞狀態較好、熒光較多的孔對應的MOI值作為正式實驗時使用的MOI值。
下面提供一種慢病毒感染細胞的預實驗以摸索MOI值的操作步驟以供參考：
別人的慢病毒感染實驗進行的如火如荼，你還在苦苦翻閱文獻查找MOI值？別急，我們來了！經過大量文獻的查閱，總結了常用人源、鼠源細胞的MOI值供您參考。
慢病毒感染后，細胞可能會出現生長狀態變差或有大量黑點出現進而影響生長等問題，下面就一起分析一下這些問題出現的原因及解決方法：
病毒溶液中殘留的雜質蛋白、內毒素等會對細胞造成一定的毒性，不同細胞對毒性的耐受力不同。如果所選擇的目的細胞對慢病毒比較敏感，則可能出現細胞狀態變差甚至死亡的現象。針對這種狀況有以下幾點解決方法：一是保證感染前細胞的生長狀態良好；二是使用高純度高滴度的慢病毒，并適當降低感染時使用的MOI值，即可在細胞準備感染時增加鋪板細胞的融合率（可提高至70%），調整感染時加入的病毒量；三是根據細胞狀態，可選擇在感染4小時后換液，用新鮮的完全培養液繼續培養觀察。
在排除細菌及真菌污染后，細胞中的黑點通常為細胞碎片。在慢病毒感染后，細胞破碎通常有兩個原因：a、慢病毒使用量過多，或細胞數量過少；b、支原體污染。由于輕度的支原體污染并不影響細胞的生長增殖，故支原體污染被許多實驗室所忽略。但支原體在病毒感染細胞后爆發，故會出現大量細胞碎片。針對以上原因建議的解決方法有：一是調整MOI值，確定合適的病毒使用量；二在使用病毒制品時，應首先排除細胞、培養物及培養環境中的支原體污染，以保證實驗的順利進行。
慢病毒已作為細胞治療的理想載體得到廣泛應用，然而在感染過程中仍會出現感染效率低的問題，下面就介紹兩種可以提高慢病毒感染效率的助感染試劑，一起來圍觀吧~
懸浮細胞是一類生長不依賴支持物表面，在培養液中呈懸浮狀態生長的細胞。與貼壁細胞相比，懸浮細胞難培養，易死亡，且不易轉染。維真生物團隊研發的慢病毒轉導增強劑 LVTE 可以解決這一難轉染問題，其使用原理是增強膜的通透性和細胞內外的跨膜轉運，促進慢病毒進入靶細胞，進而大大提升慢病毒對懸浮細胞這類難感染細胞的感染效率。
使用方法：
（1）直接加入法（適用于較易感染的細胞類型）
①進行病毒感染時，將LVTE稀釋100倍直接加入培養皿/孔/瓶中，混勻即可；
②后續操作過程依據病毒類型和實驗需要而定；
（2）離心法（適用于較難感染的細胞類型）
以“24孔培養板、人原代T細胞”為例：
① 準備細胞將狀態良好的目的細胞接種到 24 孔板中，每孔按5×10E5個待感染細胞鋪板，每孔400uL培養基；
② 選擇合適的MOI值于24孔板中加入慢病毒，再加入4uL慢病毒轉導增強劑LVTE，輕輕混勻，800g室溫離心45min；
③ 離心后將24孔板置于37℃、5%CO2 培養箱中靜置5-6h；
④ 靜置完成后在培養體系中補加800uL培養基繼續培養；
⑤ 48-72h后鑒定病毒感染效率。
維真團隊研發的 ADV-HR 通過物理吸附將病毒富集在細胞表面，從而增加病毒對細胞的感染效率，起到助感染的效果，可以提高貼壁細胞的病毒感染效率。此試劑既可以用于慢病毒感染，也可以用于腺病毒感染過程。高濃度的ADV-HR具有細胞毒性，影響細胞狀態和感染效率，建議您務必于目的細胞中進行ADV-HR濃度梯度預實驗。
使用方法：
（1）直接加入法（適用于較易感染的細胞類型）
進行病毒感染時，將ADV-HR、慢病毒直接加入培養皿/孔/瓶中，混勻即可。
（2）孵育法（適用于較難感染的細胞類型）
將ADV-HR、慢病毒和一定數量的細胞懸液加至1.5mL Eppendorf 管中，輕輕混勻，置于37℃細胞培養箱中孵育0.5-1個小時后轉移至預先加有2ml培養液的6孔板中，37℃、5%C02培養箱中培養。后續操作依病毒類型和實驗需要而定。
