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蛋白磷酸化攻略大全
前幾日，我們為大家介紹了關于反相蛋白微陣列RPPA的有關知識（『江湖召集令』癌癥相關蛋白及磷酸化水平大數據等你來分析！），利用RPPA技術可以同時分析成百上千種細胞或者組織樣本中不同蛋白的表達情況，包含修飾后蛋白（如磷酸化、甲基化、乙酰基化）的差異表達比對分析，那么，關于蛋白質翻譯后修飾你了解多少呢，蛋白質磷酸化究竟又是怎么一回事？今天，小V就和大家一起來探索有關蛋白質磷酸化的那些事兒！
蛋白質翻譯后修飾(PTMs)在生命體中具有十分重要的作用，它使蛋白質的結構更復雜，功能更完善，調節更精細，作用更專一。蛋白翻譯后修飾包括：磷酸化、糖基化、甲基化、羥基化、脂酰化、羧基化等共價修飾。其中，蛋白磷酸化是非常常見和非常重要的翻譯后修飾之一，它在每個生物的各個方面都扮演著重要的角色，例如基因轉錄、表達、細胞增殖、分化、凋亡、信號轉導、免疫調控、腫瘤發生等。
一．蛋白磷酸化簡介
蛋白磷酸化是在酶的催化作用下，將ATP γ位的磷酸基團，轉移至蛋白質氨基酸側鏈上的過程。該過程是可逆的，催化蛋白質發生磷酸化的酶被稱為蛋白激酶（protein kinase, PK），而催化蛋白質去磷酸化的酶被稱為蛋白磷酸酶（protein phosphatase, PPase）（圖1）。蛋白磷酸化是調節和控制蛋白質活性和功能的重要機制。
圖1：蛋白質磷酸化和去磷酸化的過程（圖片來源于網絡）
二．蛋白磷酸化分類及位點
蛋白磷酸化是生物體內普遍存在的一種調節方式。據報道，人類基因組編碼的21000個蛋白質中，90%以上發生了磷酸化。根據被磷酸化的氨基酸殘基不同，蛋白質磷酸化可分為 4 大類，具體分類和磷酸化位點見表1，磷酸化的9個氨基酸分子式見圖2。超過三分之一的蛋白磷酸化發生在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基上：其中絲氨酸殘基最多（86.4%），其次是蘇氨酸殘基（11.8%），酪氨酸殘基最少（1.8%）。絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的磷酸化組成了O-磷酸化。O-磷酸化在酸性條件下非常穩定，因此在細胞生物學和磷酸化蛋白質組學中研究廣泛。而N-磷酸化由于不穩定導致其檢測極具挑戰性。加之，催化N-磷酸化的蛋白激酶和蛋白磷酸酶的缺乏進一步限制了它的研究。其他兩類磷酸化（S-磷酸化和酰基磷酸化）的研究報道卻少之又少。
表1：蛋白磷酸化類型及位點
圖2：磷酸化的9個氨基酸分子式
（B. Huang et al. International Journal of Biological Macromolecules 145 .2020）
三．蛋白磷酸化相關酶
人類基因組中約有500多種激酶和200多種磷酸酶能調控蛋白的磷酸化過程，這使得蛋白磷酸化更為復雜，這些磷酸化相關酶在精細調控生物體的眾多細胞過程中可發揮關鍵作用。
四．蛋白磷酸化的檢測方法
蛋白質磷酸化的分析和磷酸化位點的鑒定已成為目前蛋白質組學研究的關注點之一。目前蛋白質磷酸化的檢測方法主要有特異性抗體（如western blot）、p32放射性標記、質譜、化學生物相結合、核磁共振等。每種方法有其各自的優缺點（表2），研究人員可根據實驗設計挑選合適的檢測方法。
表2：蛋白質磷酸化檢測方法的比較
（B. Huang et al. International Journal of Biological Macromolecules 145 .2020）
五．定點突變在蛋白磷酸化研究中的作用
定點突變可以隨心所欲地改變已知DNA序列中的堿基。在基礎研究中，科研工作者通常需要通過改變DNA序列獲得突變基因，以研究基因結構與功能之間的關系；或者通過改變氨基酸序列獲得突變蛋白，以研究蛋白質結構和功能的關系，從微觀水平闡明生理狀態下基因的調控機理、疾病的病因和發病機制。在磷酸化蛋白的研究中，構建模擬磷酸化和非磷酸化的突變實驗是研究磷酸化功能效應的一種常用方法。
1. 磷酸化位點的查找
磷酸化定點突變實驗的第一步首先要查找磷酸化位點。我們以常用的蛋白數據庫UniProt為例說明，具體步驟如下：
（1）通過//www.uniprot.org/鏈接進入UniProt官網，進入如下主界面：
（2）以人源p53蛋白為例，在Search欄（見上圖紅色標記位置）中輸入p53，進入如下界面：
六．應用實例
實例一 蛋白磷酸化與肝自噬
2018年10月，浙江大學醫學院劉教授課題組在Molecular Cell(IF=15.584)雜志發表了題為“mTORC1-Regulated and HUWE1-Mediated WIPI2 Degradation Controls Autophagy Flux”研究論文，該論文從采用質譜確定WIPI2新的互作蛋白出發，經體內外實驗發現mTORC1 & WIPI2 &HUWE1三者之間的調控關系、功能效應、生物效應和生理功能：WIPI2是mTORC1新的磷酸化底物。mTORC1通過磷酸化WIPI2，促進WIPI2與其E3泛素連接酶HUWE1的相互作用，導致WIPI2的泛素化和經蛋白酶體的降解，最終抑制自噬，調控模型示意圖見圖3。
圖5：齊墩果酸(OA)通過抑制GSK3β活性促進神經干細胞的增殖和分化
[注：Nestin (NSCs marker)；MAP2 (microtubule-associated protein-2, neuron marker)；GFAP(astrocytes marker)]
維真生物助力蛋白質磷酸化研究
