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Cre/LoxP重組系統

一(yi)．Cre/LoxP重組系統(tong)作(zuo)用原(yuan)理

1. Cre重組酶和LoxP位點

Cre重組酶（Cyclization Recombination Enzyme）由大腸桿(gan)菌(jun)噬(shi)菌(jun)體P1的(de)Cre基因編(bian)碼，是(shi)由343個(ge)氨(an)基酸組成(cheng)的(de)38kD的(de)蛋白質。它不(bu)僅具有催(cui)化活性，而且(qie)與(yu)限制酶相似，能夠特異性識(shi)別loxP位點。

LoxP（locus of X-overP1）位(wei)點長(chang)為(wei)34bp，包括(kuo)兩個13bp的(de)反向重復(fu)序列和一個8bp的(de)間(jian)隔(ge)區域。其(qi)中，反向重復(fu)序列是Cre重組酶(mei)的(de)特(te)異識別位(wei)點，而間(jian)隔(ge)區域決定了loxP位(wei)點的(de)方向。

圖1. Cre重(zhong)組(zu)酶和loxP位點

2. Cre/LoxP重(zhong)組系統誘導基(ji)因(yin)重(zhong)組的方(fang)式

Cre/LoxP系(xi)統存在幾種誘導重(zhong)組(zu)的方式，這(zhe)是基于Cre重(zhong)組(zu)酶與loxP位(wei)點的相互作用(yong)而實現的。

當基因組內(nei)存在(zai)loxP位(wei)(wei)點時，一旦有(you)Cre重(zhong)組酶，便會結合到(dao)loxP位(wei)(wei)點兩端的(de)反向重(zhong)復序列區形(xing)(xing)成二(er)聚(ju)體(ti)。此二(er)聚(ju)體(ti)與其他loxP位(wei)(wei)點的(de)二(er)聚(ju)體(ti)結合，進而形(xing)(xing)成四聚(ju)體(ti)。隨后，loxP位(wei)(wei)點之間(jian)的(de)DNA被Cre重(zhong)組酶切下(xia)，切口在(zai)DNA連接酶的(de)作用下(xia)重(zhong)新連接。重(zhong)組的(de)結果取(qu)決(jue)于loxP位(wei)(wei)點的(de)位(wei)(wei)置和方向。主要存在(zai)幾(ji)下(xia)幾(ji)種重(zhong)組方式(shi)：

（1） 兩個loxP位點位于同一條DNA鏈上且(qie)方向(xiang)相同，Cre重組酶(mei)敲除loxP間的序列；

（2） 兩個loxP位點位于同一條DNA鏈上且方向(xiang)相反，Cre重組酶誘導loxP間的序列(lie)翻轉(zhuan)；

（3） 兩個loxP位(wei)點(dian)位(wei)于不同的(de)DNA鏈或染色(se)(se)體上，Cre重(zhong)組酶誘導兩條DNA鏈發生交換或染色(se)(se)體易位(wei)；

（4） 四個loxP位點分別位于兩(liang)條(tiao)DNA鏈(lian)或染色體(ti)上(shang)，Cre重組酶誘導loxP間的序列互換。

圖(tu)2. Cre/LoxP誘導(dao)基因重組的方式

二(er)．Cre/LoxP重組系統的優(you)勢

 之所以Cre/LoxP重組系統在轉基因(yin)動物(wu)方面(mian)得到廣泛的應(ying)用(yong)，因(yin)其具有非常明顯的優(you)勢。主要體現在：時空特異(yi)、高效(xiao)性、準(zhun)確性、快速性。

圖3. Cre/LoxP重組系統的優勢

三(san)．Cre/LoxP重組系統在轉基因中的應用

由于Cre/LoxP重(zhong)組(zu)系統高效簡單的(de)(de)作用(yong)方式(shi)，它(ta)已在基因定(ding)點刪除(chu)、外源基因定(ding)點整(zheng)合、疾病動物模型建立、篩選(xuan)高效表達(da)基因座等方面得到了有(you)效利(li)用(yong)，成為(wei)體內(nei)外DNA重(zhong)組(zu)的(de)(de)有(you)力工具。

圖(tu)4. Cre/LoxP重組系統在轉基因中的應(ying)用

四．病毒(du)依(yi)賴的基因重組的優勢(shi)

應用(yong)Cre/LoxP重組(zu)系統較為常見的形(xing)式是(shi)兩種轉基(ji)因動物的雜交(jiao)。一般(ban)的策略為：

（1） 利用原核注射的(de)方法獲得轉基因“Cre小鼠(shu)”。一般利用特定啟(qi)動子控(kong)制此(ci)小鼠(shu)的(de)Cre重(zhong)組酶(mei)的(de)表達；

（2） 通過置換型載體的同(tong)源(yuan)重組，在胚(pei)胎干細胞(bao)中(zhong)向靶位點引入選擇標記基(ji)因(yin)，并在其兩側引入兩個loxP位點，要求兩條(tiao)同(tong)源(yuan)染色(se)體都(dou)帶有loxP位點，且不能干擾靶基(ji)因(yin)的轉錄。將此胚(pei)胎干細胞(bao)注入假孕母鼠(shu)中(zhong)，發育成“floxed小鼠(shu)”；

（3）“Cre小鼠”與“floxed小鼠”交配(pei)，產生(sheng)的(de)后代體內，Cre重組(zu)酶會與loxP位點發生(sheng)作用(yong)，導(dao)致(zhi)基因重組(zu)。

雖然(ran)此法具備了Cre/LoxP重(zhong)組系統的高(gao)效、特異的重(zhong)組，但(dan)存在許多不(bu)足(zu)：

目(mu)前(qian)，由(you)于病(bing)毒依賴(lai)的(de)基(ji)(ji)因重組(zu)能否克服轉基(ji)(ji)因動(dong)物(wu)的(de)諸多不足，從而成(cheng)為(wei)越來越多科研工(gong)作(zuo)者的(de)新選擇。病(bing)毒依賴(lai)的(de)Cre/LoxP重組(zu)系統的(de)策略為(wei)：

（1） 通過轉基(ji)因動物辦法獲得一只“Cre小鼠”或“floxed小鼠”；

（2） 病毒注射此“Cre小鼠”或(huo)“floxed小鼠”，引入(ru)loxP或(huo)Cre重組酶元件。

此方法(fa)優勢(shi)明顯：

五．維真為您提(ti)供Cre/LoxP重組系統的AAV載體構建(jian)和病毒包裝服務

1. 依賴Cre重組酶(mei)誘導(dao)表達的FLEX-ON系統(tong)

結合組織特異性的(de)(de)(de)啟動子和不(bu)同的(de)(de)(de)AAV血清型(xing)，維真提供的(de)(de)(de)FLEX-ON系統能幫您獲得更精準的(de)(de)(de)組織特異性控(kong)制(zhi)和時間控(kong)制(zhi)。

在(zai)FLEX-ON系統中，目(mu)(mu)的(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)反方(fang)向位于啟動(dong)子(zi)下方(fang)，兩側分別連接兩個“頭對頭”的(de)loxP。Cre重組酶(mei)不存(cun)在(zai)時，目(mu)(mu)的(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)不能表達(da)；當Cre重組酶(mei)存(cun)在(zai)時，可以誘導目(mu)(mu)的(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)“翻轉”，從而(er)表達(da)。

圖(tu)5. 維真(zhen)提供依賴Cre的(de)FLEX-ON系統示意圖(tu)（左）維真(zhen)的(de)FLEX-ON實驗圖(tu)（右）

2. 依賴Cre重組酶(mei)反(fan)式(shi)剪接(jie)系統——輕松擁有“表達大(da)基因的(de)AAV”

較小的(de)包裝能(neng)力（小于5kb）使得AAV應用受到限(xian)制。維真為(wei)您提供(gong)依賴(lai)Cre的(de)反式剪接系統，讓(rang)您輕松擁(yong)有“表達大基(ji)因的(de)AAV”。

多個重組(zu)(zu)AAV的(de)(de)(de)(de)(de)共(gong)轉(zhuan)染(ran)效(xiao)率高達(da)90%，維(wei)真(zhen)將較大(da)基因分(fen)為(wei)兩部分(fen)構(gou)建于(yu)兩個AAV載體上。通過ITR的(de)(de)(de)(de)(de)重組(zu)(zu)、mRNA剪接和Cre/LoxP消除ITR的(de)(de)(de)(de)(de)對轉(zhuan)錄的(de)(de)(de)(de)(de)抑制作用，實現目(mu)的(de)(de)(de)(de)(de)蛋白(bai)的(de)(de)(de)(de)(de)表達(da)。相比于(yu)單個載體維(wei)真(zhen)提供的(de)(de)(de)(de)(de)依賴Cre的(de)(de)(de)(de)(de)反式剪接系統的(de)(de)(de)(de)(de)表達(da)效(xiao)率約20%。

圖6. 維真提供依(yi)賴Cre的(de)(de)反式剪(jian)接系統(tong)示意圖（左）維真的(de)(de)依(yi)賴Cre的(de)(de)反式剪(jian)接系統(tong)實(shi)驗圖（右）