AAV在內耳的靶向應用策略（下）
AAV載體憑借其高安全性，低免疫原性等優勢，可以安全地轉導中樞神經系統和感官系統，并在多種疾病的基因治療中顯示出巨大潛力，這為遺傳性耳聾的治愈帶來了新的希望。目前，已有多項研究表明，使用AAV作為基因治療載體可以部分或完全恢復遺傳性耳聾小鼠模型的聽力。上期內容，我們分享了關于AAV在內耳應用中的啟動子和注射方式的選擇策略：，本期我們將繼續分享內耳應用中AAV血清型、載體的選擇和優秀案例。
一、AAV血清型選擇
1、新生小鼠
①傳統AAV血清型中，AAV1是新生小鼠內耳基因傳遞使用最廣泛的血清型之一，可轉導毛細胞、支持細胞、血管紋、前庭神經上皮多種細胞類型，并且通過圓窗膜注射方式可高效轉導內毛細胞。其它血清型AAV2、AAV6、AAV8、AAV9以不同的效率感染新生小鼠耳蝸內毛細胞（圖1）。
圖1. 相比其它天然AAV，AAV1在體外可高效轉導離體培養的小鼠耳蝸毛細胞
（Askew C, et al.Sci Transl Med.2015）
②與傳統的AAV血清型相比，變體Anc80L65可介導靶基因在新生小鼠外毛細胞和內毛細胞中的高效穩定傳遞（圖2）。
圖2. 相比傳統AAV血清型，Anc80L65在體外可高效轉導小鼠耳蝸外毛細胞和內毛細胞
（Landegger LD, et al.Nat Biotechnol. 2017）
圖3. 相比傳統AAV血清型，Anc80L65在體內可高效轉導新生小鼠耳蝸內毛和外毛細胞
（Landegger LD, et al.Nat Biotechnol. 2017）
③經后半規管注射后，變體AAV2.7m8可在體內高效轉導新生小鼠外毛細胞和內毛細胞，并且在外毛細胞轉導方面明顯優于Anc80L65（圖4）。此外，AAV2.7m8還能夠感染支持細胞亞群(內柱細胞和內指細胞)(圖5），這些支持細胞亞群被認為能夠高效促進毛細胞再生。
圖4. AAV2.7m8在體內高效感染新生小鼠耳蝸外毛細胞和內毛細胞
（Isgrig K, et al. Nat Commun. 2019）
圖5. AAV2.7m8在體內高效感染新生小鼠內耳支持細胞
（Isgrig K, et al. Nat Commun. 2019）
④經胞囊注射后，相比Anc80L65和AAV2.7m8，AAV9-PHP.B在內毛細胞和外毛細胞中均具有強的轉導效率，并在螺旋和前庭神經節神經元中顯著轉導。
圖6. AAV9-PHP.B在體內高效感染新生小鼠耳蝸外毛細胞和內毛細胞
（Lee J, et al. Hear Res. 2020）
⑤通過RWM注射，新型突變體AAV-ie-K558R可以強烈誘導新生小鼠耳蝸中HC樣細胞的再生
圖7. AAV-ie-K558R-Atoh1可在新生小鼠體內再生HC樣細胞
（Tao Y, et al.Signal Transduction and Targeted Therapy. 2022）
2、成年小鼠
在成年小鼠中，相比于AAV1、AAV8、AAV9和Anc80L65血清型，AAV2可同時高效轉導內毛細胞和外毛細胞，其次是Anc80L65血清型（圖8）。
圖8. AAV2高效轉導成年小鼠耳蝸毛細胞
（Omichi R, et al.Mol Ther Methods Clin Dev. 2020）
二、雙AAV載體選擇
AAV有限的包裝容量（約4.7kb）使其無法遞送一些較大的基因，這在一定程度上限制了其疾病治療范圍，雙AAV（或三AAV）載體技術的發展解決了這一難題。雙AAV載體遞送策略即將要遞送的大片段基因拆分并包裝到兩個AAV載體上，其中一個AAV載體攜帶啟動子元件和5’端外源基因CDS，另外一個AAV載體攜帶3’端外源基因CDS和polyA尾巴，載體兩端為ITR序列。將這兩個AAV載體共感染目的細胞后，外源基因的上下游部分根據AAV基因組的聚合能力進行重組，最終產生一個包含完整外源基因的mRNA轉錄本。目前常用的雙AAV載體策略有三種：overlapping、trans-splicing和hybrid。
圖9. 雙AAV載體策略示意圖
（Omar Akil. Hearing Research. 2020）
使用雙AAV載體遞送技術，可以將超過4 kb的編碼序列轉導到內耳，這為一系列由較大基因引起的遺傳性耳聾的基因治療開辟了可能性。例如，研究人員利用雙AAV載體方法在DFNB9耳聾小鼠模型中成功實現了Otof基因cDNA編碼序列（～6 kb）的完整表達，實現轉導細胞中Otof基因表達的持久恢復和耳聾表型的逆轉，而且該治療方法不僅可以在聽力發作前預防Otof-/-小鼠的耳聾，而且在聽力發作后給藥還可以持續逆轉耳聾表型，這為未來在DFNB9患者中進行基因治療試驗帶來了希望。
圖10. 雙AAV載體恢復P10 Otof - /- 小鼠otoferlin表達并預防耳聾
（Akil O, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019）
· 小結 ·
不同的啟動子、注射方式、血清型、病毒用量及載體遞送形式等因素均會影響AAV在內耳的基因遞送效率，因此以上數據僅供參考，建議您在具體實驗之前查閱相關文獻或技術資料，選擇合適的策略開展實驗。
三、優秀案例分享
文章題目：Template-independent genome editing in the Pcdh15av-3j mouse, a model of human DFNB23 nonsyndromic deafness
合作客戶：北京腦科學與類腦研究中心熊巍教授課題組
發表期刊：Cell Reports（IF9.995）
維真生物AAV2/9病毒感染耳蝸毛細胞效果圖
參考來源
1、//www.audiocure.com/inner-ear-disorders/；
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