AAV在內耳的靶向應用策略（上）
耳聾是一種常見的感官缺陷疾病之一，位居我國各類殘疾之首，其中60%以上的耳聾由遺傳因素引起，遺傳性耳聾在新生兒中發生率約為1/500。目前臨床上對于遺傳性耳聾的治療，主要是通過植入人工耳蝸、佩戴助聽器以及化學藥物治療，但這些都不能從根本上治療耳聾。近年來，基因治療藥物為常規方法無法治療的疾病提供了希望，截止2024年9月，全球獲批上市的基因治療藥物共54款（不含DNA和mRNA疫苗），以病毒為載體的基因療法就有16款。AAV載體憑借其高安全性，低免疫原性等優勢，可以安全地轉導中樞神經系統和感官系統，并在多種疾病的基因治療中顯示出巨大潛力，這為遺傳性耳聾的治愈帶來了新的希望。目前，已有多項研究表明，使用AAV作為基因治療載體可以部分或完全恢復遺傳性耳聾小鼠模型的聽力。
耳朵結構
耳朵分為外耳、中耳和內耳三部分，其中外耳和中耳傳導聲波，內耳是聽覺和位覺感受器。在結構上，外耳包括耳廓和外耳道，中耳由鼓膜、鼓室及聽骨鏈組成，內耳位于顳骨巖部內，包括半規管、前庭和耳蝸（cochlea）。值得注意的是，大多數引起耳聾的基因主要在耳蝸內的細胞中表達，因此，AAV介導的針對聽力損失的基因療法一般都集中于靶向耳蝸結構。
哺乳動物的耳蝸內含有兩種類型的毛細胞（Hair Cells, HCs）：內毛細胞(IHCs)和外毛細胞(OHCs)，這兩種毛細胞對聽覺信號的檢測和處理至關重要，成熟的哺乳動物毛細胞不能再生，因此這些細胞一旦發生損傷，其退化過程往往是不可逆的。支持細胞(Supporting cells, SCs)圍繞在毛細胞外周，對耳蝸內穩態十分重要，引起先天性耳聾的GJB2基因即在支持細胞中表達。螺旋神經節神經元（Spiral Ganglion Neurons, SGNs）是聽覺系統的一級神經元，在聽覺傳導過程中起重要作用。
此外，由毛細胞、支持細胞及其它附屬結構構成了Corti器（柯蒂氏器），Corti器周圍是充滿外淋巴管的前庭階（Scala vestibuli）、鼓階（Scala tympani）以及充滿內淋巴管的蝸管（Scala media）。
圖1. 耳朵結構分析
（//www.audiocure.com/inner-ear-disorders/）
（Peters CW, et al. Trends Pharmacol Sci. 2021）
AAV靶向內耳策略
1、啟動子選擇
· 組成型啟動子
CMV和CBA已被證明可驅動耳蝸毛細胞、支持細胞等多種細胞類型中的轉基因表達，Pgk1（磷酸甘油酸激酶1）啟動子則可驅動外源基因在支持細胞中表達。
圖2. CMV、CBA和Pgk1啟動子驅動外源基因在離體培養小鼠耳蝸細胞中的表達
（Askew C, et al.Sci Transl Med.2015）
· 特異性啟動子
Syn1（突觸素1）啟動子可驅動外源基因在耳蝸螺旋神經節神經元中的有效轉導，Myo7a（人肌球蛋白ⅦA）、Pou4f3（POU結構域第4類轉錄因子3）和Slc26a5（溶質載劑家族26成員5）是轉導毛細胞的可選啟動子，使用時應考慮AAV的包裝容量。
圖3. Syn1啟動子驅動外源基因在離體培養小鼠耳蝸耳蝸螺旋神經節神經元中的表達
（Askew C, et al.Sci Transl Med.2015）
2、注射方式選擇
應用于內耳的注射方式主要有：圓窗膜（RWM）注射、耳蝸造口術（Cochleostomy）、后半規管(PSCC)注射及胞囊（Utricle）注射。
·圓窗膜（RWM）注射是新生小鼠以及非人靈長類動物（NHPs）中常用的方法，載體可傳送至耳蝸鼓階的外淋巴。該注射方法對內耳外毛細胞轉導率相對有限。
·后半規管(PSCC)注射能使病毒載體有效地感染新生小鼠耳蝸和前庭器官的細胞。該方法同樣具有侵入性，可能會有損傷毛細胞的風險。
·耳蝸造口術（Cochleostomy）涉及穿透側壁，一般在成年受試者耳蝸骨鈣化后使用，載體可輸送至蝸管的內淋巴。該方法具有侵入性，可能會有損傷毛細胞的風險，造成聽力損害。
·胞囊注射可能會使載體傳遞至內淋巴，已被證明可在耳蝸中實現多種AAV血清型的高水平表達，研究表明在相同血清型、啟動子、病毒滴度及注射體積條件下，胞囊注射方法在新生小鼠內耳IHCs和OHCs中的轉導率均略高于RWM注射法。
圖4. 耳蝸內的不同注射途徑
（Maguire CA, et al. Hear Res. 2020）
下面介紹圓窗膜（RWM）注射、后半規管（PSCC）注射和耳蝸造口術注射方式的操作步驟：
1、圓窗膜（RWM）注射
1) 腹腔注射氯胺酮(100mg /kg)、甲苯噻嗪(10mg /kg)和乙酰丙嗪(2mg /kg)混合物麻醉小鼠，確保小鼠對疼痛刺激（如腳趾夾）無反應后，才能開始手術準備；
2) 在小鼠眼睛上涂抹保護性的藥膏，使其在麻醉期間保持眼睛濕潤，并抑制眨眼反射；
3) 在整個過程中，將小鼠的頸部伸展放在加熱墊上，直到小鼠完全清醒，以防止麻醉后體溫過低；
4) 用剃刀刮掉小鼠耳后的毛發，并用70%乙醇和聚維酮碘消毒；
5) 在外耳下方做一個切口，將軟組織推開，露出鼓室大皰；
6) 用25G針在鼓室大皰上穿孔，然后充分擴大以可見鐙骨動脈（SA）和圓窗膜(RWM)；
7) 用硼硅酸鹽毛細管移液管在RWM中心輕輕穿刺，觀察液體通過RWM的流出情況(耳蝸流出的液體用無菌濾紙干燥)；
8) 在射流穩定后(5-10 min)，將0.6~2μL的AAV載體通過RWM注射到耳蝸鼓階；
9) 拔出移液管后，用一小塊肌肉組織迅速密封RW龕，并在肌肉上滴一小滴組織膠固定，以避免耳蝸周圍淋巴液通過RWM滲漏；
10) 注射完畢后，用脂肪組織覆蓋大皰孔，將耳后肌和脂肪組織恢復正常位置，用6-0或更小的可吸收鉻線分層縫合傷口，并作消毒處理；
11) 把小鼠放在一個溫暖干凈的籠子里觀察看護，待其完全恢復；
12) 術后皮下注射卡洛芬（2 mg/kg）進行鎮痛，此后每24小時注射一次，持續3天，以控制炎癥和疼痛。每天監測動物是否有痛苦、體重異常減輕、疼痛或感染的跡象。一般情況下，所有小鼠在手術后第三天應能正常活動。
圖5. 圓窗膜（RWM）注射
（Akil O, et al.Methods Mol Biol. 2019）
2、后半規管（PSCC）注射
1) 通過腹腔注射氯胺酮(100 mg/kg)和甲苯噻嗪(20 mg/kg)麻醉小鼠；
2) 用剃刀刮掉小鼠左耳后的毛發，并用10%聚維酮碘消毒；
3) 對耳后皮膚做一個15mm的切口，解剖暴露面神經及胸鎖乳突肌后，切除近端部分肌肉；
4) 使用4-0 vicryl縫合線將覆蓋顳骨的肌肉分離并向背側收回，露出后半規管的骨壁，清晰可見為一條深色條紋；
5) 使用26號皮下注射針在后半規管附近扎一個小孔，等待5min，待外淋巴液滲漏減輕后，將聚酰亞胺管的尖端以貼近壺腹部的方式插入后半規管中；
6) 聚酰亞胺管與小孔之間的縫隙用肌肉碎片和氰基丙烯酸酯膠密封，通過無液體泄漏直觀評估密封的嚴密性；
7) 將250 nL的病毒懸液以100 nL/min的速度在2.5 min內注入后半規管中，注射后將試管留在后半規管中靜置5min；
8) 取出管子后，用小塊肌肉堵住小孔，并涂上氰基丙烯酸酯膠水，最后用5-0尼龍縫合線縫合傷口；
9) 把小鼠放在一個溫暖干凈的籠子里，待其完全恢復。
圖6. 后半規管（PSCC）注射
（Suzuki J, et al. Sci Rep. 2017）
3、耳蝸造口術
1) 通過腹腔注射甲苯噻嗪（10mg/kg）和氯胺酮（100mg/kg）麻醉小鼠；
2) 對小鼠右耳后區域進行剃毛，并用10%聚維酮碘消毒；
3) 在手術顯微鏡下，于耳后做一個長約10 mm的切口，提取右側耳廓及胸鎖乳突肌，暴露位于顳骨邊緣的PSCC；
4) 用波恩微型探針在PSCC上鉆一個小孔，等待幾分鐘，直到沒有明顯的外淋巴液流出；
5) 將聚酰亞胺管的尖端插入PSCC中，并使用組織粘合劑密封小孔，確保沒有外淋巴液流出；
6) 利用MICRO4微量注射控制器控制聚酰亞胺管進行病毒注射，速率179nL/min，每次注射病毒總體積為1 μL或2 μL，時間控制在5-10min；
7) 注射后切斷聚酰亞胺管，留下約5mm與PSCC相連。用組織粘合劑密封殘留的管孔，然后用5-0 Ethilon線縫合皮膚；
8) 把小鼠放在一個溫暖干凈的籠子里觀察看護，待其完全恢復。
以上是關于AAV在內耳應用中的啟動子和注射方式的選擇策略，下期我們將繼續分享內耳應用中AAV血清型和載體的選擇，敬請期待~
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