應用篇|AAV在肌肉組織中的靶向策略
前期我們為大家分享了AAV在肌肉組織中的血清型、啟動子、注射方式選擇策略,本期精選了幾篇AAV靶向肌肉組織的客戶案例供參考~
1、ULK1-mediatedmetabolic reprogramming regulates Vps34 lipid kinase activity by itslactylation
自噬是一種進化上非常保守的由溶酶體介導的生物降解過程,對細胞內穩態具有重要的調控作用。自噬過程由復雜的分子網絡調控,包括UNC-51樣激酶1(ULK1)復合物、III類磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)復合物及多種自噬相關基因。此外,磷酸化、糖基化、泛素化和乙酰化等在內的翻譯后修飾(PTMs)也介導自噬發生。最近的研究表明,乳酸可以驅動組蛋白和非組蛋白的賴氨酸乳酸化,是一種新的翻譯后修飾,并以糖酵解依賴的方式調節巨噬細胞、體細胞、癌細胞和腦細胞的基因表達和蛋白活性。然而,乳酸化是否參與調節自噬機制目前尚不清楚。華東理工大學的研究團隊發現ULK1通過磷酸化乳酸脫氫酶A(LDHA)促進乳酸產生,并進一步乳酸化Vps34激活其激酶活性,促進細胞自噬發生和內體-溶酶體降解途徑,揭示了糖酵解代謝產物乳酸調控細胞自噬的新機制,以及Vps34乳酸化在肌肉運動穩態和腫瘤進展中的作用。

自噬通過消除異常線粒體和內含體在維持骨骼肌穩態中起關鍵作用。通過強迫游泳實驗評估Vps34乳酸化的生理功能,作者發現小鼠肌肉劇烈運動誘導AMPKα(Thr172)、總mTOR、ULK1 (Ser555)、LDHA (Ser196)的上調并產生大量乳酸,同時誘導細胞自噬,促進Vps34的乳酸化,增加PtdIns(3)P水平。將對照病毒、rAAV-Vps34WT或rAAV-Vps342KR注射進小鼠骨骼肌,4周后進行急性游泳運動,Vps34WT的給藥增強了肌肉自噬水平,而給藥Vps342KR使肌肉自噬水平部分受損。這些結果表明,Vps34的乳酸化是骨骼肌細胞自噬和細胞穩態所必需的。
Vps34的乳酸化在骨骼肌穩態中起重要作用
2、 Improved efficacy of FKRP AAV gene therapy by combination with ribitol treatment for LGMD2I
糖基化相關蛋白異常先天性肌營養不良(dystroglycanopathy)是一組新生兒或嬰兒期起病、具有明顯臨床表現和遺傳異質性的肌營養不良性疾病,FKRP基因的突變易導致dystroglycanopathy,疾病嚴重程度從輕度LGMD2I到重度CMD。近年來,針對該類疾病的AAV基因治療和ribitol(核糖醇)治療均顯示出顯著的療效,然而每種治療方法都有其優缺點。Atrium Health卡羅來納醫療中心的研究團隊在FKRP-P448L突變小鼠中檢測了AAV基因治療和ribitol的聯合治療效果。研究結果證實,長期單獨使用核糖醇治療可以改善營養不良小鼠的病理、肌肉功能和壽命,但聯合AAV-FKRP基因治療比單獨治療更有效,揭示了核糖醇與AAV基因療法聯合治療FKRP相關肌營養不良的潛在益處。

為了研究核糖醇治療聯合AAV基因治療的潛在益處,作者給5周大的P448L小鼠服用補充有5%核糖醇的飲用水,4周后單尾靜脈注射高、低劑量的AAV9-FKRP。結果表明,FKRP基因治療和核糖醇治療可增加營養不良FKRP-P448L突變小鼠的體重并延長其壽命,同時增加小鼠心臟和骨骼肌中的基質聚糖。隨著小鼠的衰老,小鼠的橫膈膜會出現進行性纖維化,在治療后6個月,未經治療的P448L小鼠橫膈膜表現出廣泛的變性及纖維化,約占據組織區域的40%以上,核糖醇治療的小鼠纖維化面積降到22%,而在高、低劑量AAV-FKRP聯合治療的小鼠中纖維化面積進一步降到12%,表明核糖醇和AAV-FKRP聯合治療可改善FKRP-P448L突變小鼠的病理學。
核糖醇聯合AAV-FKRP基因治療對P448L小鼠膈纖維化進展的影響
3、The mitochondrial calcium uniporter underlies metabolic fuel preference in skeletal muscle
線粒體Ca2+單向轉運蛋白(MCU)復合物介導急性線粒體Ca2+內流。在骨骼肌中,MCU通過直接增強線粒體中關鍵代謝酶的活性,將Ca2+信號傳導與能量產生聯系起來。辛辛那提兒童醫院的研究人員通過建立胚胎、出生后和成年時期骨骼肌中靶向缺失MCU的小鼠模型,研究了MCU在骨骼肌發育和代謝功能中的作用。研究結果表明Mcu的缺失不會影響肌肉的生長和成熟,也不會引起病理,小鼠骨骼肌特異性Mcu缺失也不影響肌纖維細胞內Ca2+處理,但抑制了Ca2+刺激的急性線粒體Ca2+內流和線粒體呼吸,導致小鼠急性運動能力下降。然而,Mcu的損失也導致疲勞條件下肌肉性能的增強,優先轉向脂肪酸代謝,導致體脂隨著年齡的增長而減少。總之,這些結果表明,MCU介導的線粒體Ca2+調節是基線和生理需求增強條件下骨骼肌燃料選擇的基礎,影響了總的穩態代謝。
為了研究MCU對成年骨骼肌生長的貢獻,一方面,研究人員將Mcufl/fl小鼠與SKa-MCM(在骨骼肌α-肌動蛋白啟動子控制下表達他莫昔芬誘導的Cre重組酶)小鼠雜交,構建Mcu缺失小鼠。分析數據表明Mcu缺失小鼠骨骼肌線粒體中的MCU蛋白水平降低了90%以上,線粒體Ca2+攝取減弱,但這種損害并未影響小鼠肌肉重量和組織完整性。另一方面,研究人員將表達Cre重組酶的AAV9直接注射到6周齡的Mcufl/fl小鼠脛骨前肌(TA)中,將成年小鼠肌肉組織Mcu特異性敲除。病毒轉導后8周,與AAV9-GFP對照組相比,AAV9-Cre轉導小鼠的TA肌肉裂解物中MCU蛋白水平顯著降低,但未觀察到TA肌肉重量的變化,也沒有組織病理學表現,總之,這些結果表明,MCU依賴性Ca2+信號的喪失與骨骼肌生長或組織結構的顯著變化無關。
線粒體Ca2+內流不調節出生后骨骼肌的生長
4、Endothelium-targeted delivery of PPARδ by adeno-associated virus serotype 1 ameliorates vascular injury induced by hindlimb ischemia in obese mice
糖尿病血管病變是造成糖尿病人群發病和死亡的主要原因,外周動脈疾病(PAD)是其主要形式之一。PAD是一種以向下肢提供血液和營養的動脈狹窄和閉塞為特征的動脈粥樣硬化性心血管疾病,嚴重時可發展成重癥肢體缺血(CLI),已知肥胖和胰島素抵抗與PAD和CLI的發病率呈正相關。目前,抗炎、刺激血管重建和肌肉再生是治療CLI的關鍵途徑,但是由于缺乏有效的治療靶點和途徑,針對CLI的臨床治療效果是有限的。過氧化物酶體增殖物激活受體δ (PPARδ)是一種配體激活的核轉錄因子,屬于核受體超家族。使用PPARδ激動劑激活PPARδ對血管內穩態和冠狀動脈疾病有顯著治療效果,然而其副作用在很大程度上限制了該治療方法的進一步應用。香港中文大學的研究團隊探索了AAV載體介導的PPARδ傳遞對下肢缺血誘導的血管損傷的治療效果,研究表明在肥胖和胰島素抵抗的情況下,PPARδ在內皮穩態中發揮關鍵性保護作用。利用AAV1靶向內皮細胞轉導PPARδ的基因療法有助于缺血性損傷后功能性血管系統恢復,包括增強血流恢復,增加毛細血管密度,恢復內皮完整性,抑制血管炎癥,并能促進肌肉的再生,突出了PPARδ在PAD和CLI患者治療中的潛在巨大價值。

鑒于PPARδ在血管穩態中的作用具有非配體依賴性,研究人員探究了在HLI小鼠模型中恢復內皮細胞PPARδ的表達是否可以改善血管內皮功能障礙和促進血管修復。研究人員利用AA1-ICAM2成功在PpardEC-KO和PpardEC-WT小鼠體內進行了Ppard基因傳遞。數據分析表明,AAV1-Ppard加速了PpardEC-WT小鼠的下肢灌注恢復,同時也恢復了PpardEC-KO小鼠的下肢損傷。進一步的組織學分析表明, AAV-Ppard組在肌肉損傷后恢復更好,纖維化減少以及GA肌肉質量減少降低,尤其在 AAV-Ppard注射的PpardEC-KO小鼠中表現更為明顯。此外,AAV-Ppard注射恢復了HLI損傷后PpardEC-KO小鼠的內皮細胞功能,抑制了血管炎癥。
恢復內皮細胞PPARδ表達可改善HLI后PpardEC-KO小鼠血管功能
5、Expression of Myomaker and Myomerger in myofibers causes muscle pathology
骨骼肌的發育和再生依賴于肌源性祖細胞的細胞融合來產生多核肌纖維,這些祖細胞利用Myomaker和Myomerger兩種肌肉特異性融合原,它們通過重塑細胞膜相互融合或與現有肌纖維融合而發揮作用。Myomaker和Myomerger的表達僅限于分化祖細胞,因為它們在成年肌纖維中未被檢測到,然而,肌營養不良小鼠的肌纖維中仍然表達Myomaker。辛辛那提兒童醫院的研究團隊評估了肌纖維區室中Myomaker和Myomerger活性的影響,研究發現肌纖維中Myomaker或Myomerger的表達在急性時間點獨立引起膜損傷,這種損傷導致肌肉病理,表現為中央有核肌纖維和肌肉萎縮,與融合蛋白自身的表達相比,肌纖維中Myomaker和Myomerger的雙重表達加劇了肌肉病理學。數據表明,雖然肌纖維可以耐受一定水平的Myomaker和Myomerger,但超過閾值的單個融合蛋白的表達或兩種融合蛋白的共同表達對肌纖維是有害的,強調了在肌肉發生和融合過程中高度限制融合蛋白表達的必要性。

研究人員將AAV9-Myomerger或AAV9-GFP(對照)通過肌肉注射的方式注射到2月齡野生型小鼠的TA中,2周后收集肌肉進行Western印跡分析證實AAV9-Myomerger的成功轉導。AAV9-Myomerger注射后觀察到TA中心成核,表明肌纖維損傷和隨后的再生;免疫熒光顯示,與誘導型模型相比,AAV9-Myomerger在每根肌纖維上的表達顯著更高,揭示肌纖維可能具有它們可以耐受的Myomerger表達閾值。
Myomerger表達升高導致肌肉再生