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腎臟疾病已成為威脅人類健康的主要疾病之一，全球約有13%人口受其影響。已知由基因突變引起的慢性腎臟疾病的發病率可高達千分之一，近80種基因的突變都與各種遺傳性腎臟疾病有關。然而，由于腎臟結構和功能的復雜性，針對腎臟疾病的基因治療的研究和開發滯后于肝臟、神經肌肉和眼睛等。自20世紀90年代末以來，研究人員已經開始利用AAV進行體內外腎臟的基因傳遞研究，并取得一定的成果，然而所帶來的實際轉導效果存在很大程度的不同，這可能與不同的傳遞方式以及不同的AAV血清型等因素有關。如何實現或者更大程度上實現外源基因在腎臟中的轉導成為影響腎臟基因治療發展的關鍵。
給藥途徑的選擇是基因治療有效性的重要決定因素。哺乳動物的腎臟具有嚴格的過濾功能，排斥大于50kDa的蛋白質，此外，腎小球內的足細胞形成直徑僅為10nm的狹縫橫膈膜，傳統的AAV載體全身給藥難以在腎臟達到足夠的表達水平，即便是高劑量給藥也會導致AAV集中在肝臟等腎外器官中。為了提高病毒載體對腎臟的轉導并降低病毒載體對腎外器官的轉導效率，除了全身給藥方式外，近年來，科學家陸續開發了腎臟局部給藥途徑包括腎動脈注射、腎靜脈注射、經腎實質注射、經輸尿管逆行給藥和經腎實質腎盂注射等(圖2)。
如下表所列，這些以手術為基礎的AAV給藥方法實現了外源基因在腎臟中不同分布模式，且具有不同的特點。
| AAV腎臟給藥方式 | 基因表達分布 | 特點 |
|---|---|---|
| 腎靜脈注射 | 皮質和髓質中表達，主要在腎小球和近端小管中 | 難以突破腎小球屏障，效率較低 |
| 腎動脈注射 | 近端小管和腎集合管 | 技術挑戰性強 |
| 腎實質注射 | 僅限于注射針道周圍 | 操作相對簡單 |
| 經輸尿管腎盂逆行注射 | 腎臟管道系統 | 克服腎小球屏障限制，操作難度大 |
| 經腎實質腎盂注射 | 皮質和髓質的腎小管上皮細胞中，主要是集合管細胞 | 新注射方式，操作簡單，基因表達穩定 |
下面對腎靜脈注射、經輸尿管逆行注射和經腎實質腎盂注射三種注射方式進行簡單分享：
①對C57BL/6 小鼠（4-6 周齡，15-20g）進行麻醉手術，并使小鼠呈仰臥姿勢于操作臺上；
②給小鼠左腹剃毛，在小鼠左腹部做一個切口，暴露左腎及腎蒂，并將腎靜脈從腎蒂中游離；
③用顯微止血夾夾住腎靜脈遠端以阻止病毒原液流出腎臟；
④用30G注射針刺入左腎靜脈近端，將50μL液體（含有 5x1010個病毒顆粒基因組拷貝數或 PBS）注入腎靜脈；
⑤5min后，拔出注射針，移去顯微止血夾并壓迫止血片刻，將切口分兩層縫合。
①對C57BL/6 小鼠（4-6 周齡，15-20g）進行麻醉手術，并使小鼠呈仰臥姿勢于操作臺上；
②在小鼠左腹部做一個切口并輕輕剖開，找到輸尿管遠端和腎動脈并用顯微止血夾夾住；
③用 30G注射針刺破輸尿管，將注射針貼合于管壁并固定到位，使用 6-0縫線縫合以防液體泄漏；
④將尿液輕輕吸出，將注射器替換為另一個含有約 50μL液體（含有 5x1010個病毒顆粒基因組拷貝數或PBS）的注射器，并緩慢地將液體逆行注入輸尿管；
⑤將注射針撤出，并在注射部位的近端放置一個顯微止血夾以防液體泄漏；
⑥5min后，移去輸尿管遠端、近端及腎動脈上的顯微止血夾，用6-0縫線將切口分兩層縫合。
①對C57BL/6 小鼠（4-6 周齡，15-20g）進行麻醉手術，并使小鼠呈仰臥姿勢于操作臺上；
②對小鼠左腹進行剃毛處理，切開一個2cm的切口暴露左腎和輸尿管，并將周圍器官和脂肪輕輕分開；
③用顯微止血夾夾住輸尿管上段以阻止病毒原液下流至膀胱；
④用30G注射針刺入左腎中極的腎盂（注意注射針頭不應刺穿腎盂），將50μL液體（含5x1010個病毒顆粒基因組拷貝數或PBS）注入腎盂；
注：注射針刺入腎盂而不刺穿腎盂的關鍵在于注意比對穿刺針和小鼠腎臟，并且在注射針上做好標記；
⑤5min后移去顯微止血夾，將切口分兩層縫合。
腎臟研究中常用的AAV載體有 AAV2、AAV6、AAV8 和AAV9，其中以AAV9型居多。
1. 在腎臟的尾靜脈注射轉導中，rAAV8和rAAV9的腎臟轉導效率和轉錄活性優于rAAV2，rAAV9更優。
實驗動物：6周齡雄性129/Sv小鼠
注射方式：尾靜脈注射
注射量：5×1011vg
啟動子：CMV
數據來源于：Combined Paracrine and Endocrine AAV9-mediated Expression of Hepatocyte Growth Factor for the Treatment of Renal Fibrosis.
2. Rocca et al. 利用腎靜脈逆行注射技術將AAV5, AAV6, AAV8以及AAV9注入小鼠腎臟，不僅證實腎靜脈逆行注射比尾靜脈注射有更好的腎基因轉導效果，而且發現在四種AAV血清型中，AAV9更能同時高效轉導皮質和髓質（AAV6轉導髓質效果更好，但對皮質轉導效率較低），此外，AAV9均能有效靶向腎小球和近端小管且在腎小球內效率更高（圖4）。
實驗動物：2月齡C57BL/6小鼠
注射方式：腎靜脈注射
注射量：100 μL，5×1010 particles
啟動子：CMV
數據來源于：rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidneytargeted gene delivery: conclusion of a comparative study.
以小鼠為例，一般情況下，AAV在腎臟中的給藥劑量通常在10E10-10E11VG/只（需要根據注射方式靈活調整），根據病毒實際滴度，注射體積在50-100μL左右。
腎臟研究中可以選擇廣譜性啟動子CMV，也可以選擇特異性啟動子NPHS1，增加腎臟靶向性。
實驗動物：17周齡C57BL/6懷孕母鼠；
注射方式：尾靜脈注射
病毒：AAV9-NPHS1-eGFP（White） ； AAV9-CMV-eGFP（Black）
注射量：1×1012 vg/mouse
小結： AAV轉導腎基因的效率應結合注射方式、血清型及啟動子等多方面綜合考慮，建議在進行實驗前查閱相關文獻并進行預實驗測定。
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AAV在腎臟研究中的案例分享『應用篇』 （可點擊查看）
