『應用篇』AAV在肺部應用中的靶向策略
上一期小V和大家一起學習了關于rAAV在肺部實驗中的啟動子、血清型以及注射方式的選擇策略（），今天我們將和大家一起通過幾個具體案例深入了解一下關于AAV在肺部研究中的應用策略。
維真生物AAV注射肺部案例展示
1、“SERPINB10 contributes to asthma by inhibiting the apoptosis of allergenic Th2 cells”
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哮喘（Asthma）是由多種細胞（如嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞、氣道上皮細胞等）和細胞組分參與的慢性炎癥性疾病，常伴隨有氣道炎癥、氣道高反應性、大量粘液分泌和氣道重塑的特征。研究表明，輔助型T細胞2（Th2）及其分泌的細胞因子與哮喘發病機制密切相關；絲氨酸蛋白酶抑制劑家族成員SERPINB10與哮喘的過敏性炎癥有關，但其在過敏性哮喘Th2應答中的作用尚不清楚。
在本研究中，作者通過抑制小鼠SERPINB10表達（利用AAV6載體進行氣管內注射），發現屋塵螨(HDM)誘導的氣道炎癥和Th2反應有所緩解，HDM誘導的Th2細胞因子分泌和HDM特異性IgE水平顯著降低，且誘導了Th2的凋亡增加。本文揭示了SERPINB10通過抑制Th2細胞的凋亡促進哮喘的炎癥發生，闡明了SERPINB10在過敏性哮喘Th2反應中的重要作用。
如圖1所示，研究人員通過HDM誘導構建了哮喘小鼠模型，借助AAV6下調SERPINB10的表達，結果發現小鼠肺組織中SERPINB10的轉錄水平和蛋白表達水平均顯著降低，干擾率約為74.2%。AAV6-SERPINB10 shRNA對于HMD誘導的SERPINB10高表達同樣可以起到很好的干擾效果，并表現為持久有效地抑制。
圖1. AAV6-Serpinb10shRNA干擾效率檢測
2、“circHIPK3 regulates lung fibroblast-tomyofibroblast transition by functioning as a competing endogenous RNA”
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特發性肺纖維化（IPF）是一種慢性、進行性、纖維化性間質性肺疾病，發病機制尚不完全清楚，迫切需要新的靶向藥物來阻止其纖維化過程。肺內形成由肌成纖維細胞組成的纖維化灶和細胞外基質(ECM)蛋白的異常表達是IPF的顯著病理特征，而肌成纖維細胞主要來源于成纖維細胞轉化（FMT），因此，了解IPF中FMT過程的調控機制或許將會為IPF治療提供新的靶點。circHIPK3已被鑒定在肺中高表達，且在人成纖維細胞中富集。然而，circHIPK3是否參與介導成纖維細胞的生物學功能尚不清楚。
研究人員利用博萊霉素(BLM)制備IPF小鼠模型，探究了circHIPK3在肺纖維化中的作用，發現circHIPK3在肺纖維化小鼠模型，FMT衍生的肌成纖維細胞中表達上調；沉默circHIPK3（通過AAV6載體進行氣管內注射）可以在體內外抑制成纖維細胞增殖并改善FMT。從機制上來講，circHIPK3作為內源性miR-338-3p的海綿調控FMT：circHIPK3通過抑制miR-338-3p活性導致FMT調控因子SOX4和COL1A1表達增加。總的來說，circHIPK3的干預可能為肺纖維化的治療提供新的見解。
如圖2所示，通過氣管內注射AAV6-circHIPK3 shRNA顯著降低了circHIPK3在肺中的表達，沉默circHIPK3后減弱了BLM誘導的肺纖維化小鼠中的膠原沉積，并降低了肌成纖維細胞標記物α-SMA和Col-1的表達水平。這些結果表明，circHIPK3沉默顯著改善了BLM誘導的肺纖維化，抑制肺成纖維細胞增殖。
圖2. circHIPK3沉默可減輕BLM誘導的肺纖維化并改善體內成纖維細胞功能障礙
3、“Sirtuin 6 inhibits epithelial to mesenchymal transition during idiopathic pulmonary fibrosis via inactivating TGF-β1/Smad3 signaling”。
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特發性肺纖維化(IPF)是一種不可逆、進行性、平均生存期短的間質性肺疾病，其特征是細胞外基質(ECM)過度沉積和肺結構受損，目前尚無有效的治療方法，迫切需要從機制上了解其發病機制，以開發治療這一疾病的新方法。目前已發現上皮向間質轉化（EMT）參與了特發性肺纖維化的發病機制，確定調節EMT或將間充質細胞去分化為上皮細胞的關鍵分子是抑制或逆轉IPF的一種有吸引力的治療策略。SIRT6參與控制衰老、癌癥和新陳代謝，已被證明在心臟和肝臟具有抗纖維化功能。然而，SIRT6是否參與肺EMT，抑制特發性肺纖維化（IPF）尚不清楚。
在本研究中，研究人員首先通過體外研究發現，在TGF-β1誘導的A549細胞中Sirt6表達上調，且過表達Sirt6可負調控EMT進程，EMT相關轉錄因子的表達和間充質細胞行為。隨后通過體內研究表明，通過AAV載體使Sirt6在小鼠肺部成功表達，可以消除博萊霉素（BLM）誘導的EMT樣表型和肺纖維化，揭示了Sirt6在肺EMT過程中的關鍵作用，并可能成為特發性肺纖維化的一個潛在治療靶點。
如圖3所示，通過氣管內注射AAV-Sirt6后，Sirt6在肺泡壁成功表達，Sirt6過表達明顯消除了博來霉素誘導的EMT表型并緩解了肺纖維化。
圖3. AAV-Sirt6可改善博萊霉素誘導的肺EMT
4、“lncRNA ZFAS1 promotes lung fibroblast-to-myofibroblast transition and ferroptosis via functioning as a ceRNA through miR-150- 5p/SLC38A1 axis”。
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越來越多的證據表明，lncRNA參與了肺纖維化（PF）的多種病理生理過程，其中lncRNA ZFAS1被報道可能參與了PF進展，但其作用及機制有待進一步闡明。在本研究中，作者發現lncRNA ZFAS1在博萊霉素(BLM)誘導的PF大鼠肺組織和TGF-β1處理的HFL1細胞中表達上調，并與脂質過氧化的重要調節因子SLC38A1的表達呈正相關。此外，lncRNA ZFAS1的體內外敲低實驗表明，干擾lncRNA ZFAS1的表達可以抑制BLM誘導的脂質過氧化和PF的形成，伴隨SLC38A1的下調。最后，作者揭示了lncRNA ZFAS1/miR-150-5p/SLC38A1通路在PF進展中的作用，這可能為PF患者的治療提供新的靶點。
腹腔注射表達lncRNA ZFAS1 的AAV5敲低載體后，明顯減弱了BLM誘導的肺纖維化特征。此外，lncRNA ZFAS1的敲低顯著增加了BLM誘導的PF大鼠模型肺組織中miR-150-5p的表達，并降低了SLC38A1 mRNA的表達，同時減弱了BLM誘導的炎性因子的表達、脂質過氧化和鐵死亡。總的來說，lncRNA ZFAS1的下調通過調節miR-150-5p/SLC38A1通路顯著減弱BLM誘導的肺纖維化和鐵死亡（圖4）。
圖4. lncRNA ZFAS1敲低通過調控miR-150-5p/SLC38A1通路阻斷BLM誘導的PF
5、“ALDH2 (Aldehyde Dehydrogenase 2) Protects Against Hypoxia-Induced Pulmonary Hypertension”。
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肺動脈高壓（pulmonary hypertension，PH）是由多種已知或未知原因引起的肺動脈壓異常升高的一種病理生理狀態。缺氧性肺動脈高壓(HPH)是常見的PH類型，目前尚無有效治療藥物，因此，有必要深入了解HPH的潛在機制，以確定潛在的新治療靶點。HPH會導致肺動脈平滑肌細胞PASMCs過度增殖，并促進脂質過氧化，產生包括4-羥基壬烯醛(4-HNE)等在內的有毒醛。有研究表明，醛脫氫酶2(ALDH2)作為重要的醛類解毒酶，可通過清除脂質過氧化產生的有毒醛，特別是4-HNE，能在心肌損傷和中風中起保護作用，且ALDH2的激活可以緩解野百合堿誘導的肺動脈高壓，盡管如此，ALDH2在HPH中的作用及其潛在機制尚未被充分研究。
為了確定ALDH2 在HPH的作用, 研究人員以ALDH2轉基因小鼠、C57BL/6J小鼠,和ALDH2基因敲除(ALDH2?/?)小鼠為實驗對象，將其暴露在慢性缺氧環境中，發現慢性缺氧促進了肺組織中4-HNE的產生，HPH小鼠肺組織中ALDH2表達下調。隨后通過多種途徑證明ALDH2的激活可降低4-HNE的水平，減輕HPH的發生程度，并調控PASMCs的增殖和遷移。
肺動脈平滑肌細胞和內皮細胞在HPH的發生發展中發揮重要作用，為確定ALDH2通過哪種細胞在HPH中發揮作用，研究者利用AAV1 -ICAM2-ALDH2和AAV2-SM22α-ALDH2分別在小鼠肺動脈內皮細胞和平滑肌細胞中特異性過表達ALDH2，發現尾靜脈注射AAV病毒后，平滑肌細胞或內皮細胞中均出現強烈的GFP熒光信號，且右心室收縮壓RVSP、右室肥厚指數RVH和肺血管肌化的檢測結果表明，在肺動脈平滑肌細胞而非內皮細胞中特異性過表達ALDH2可抑制HPH的發生（圖5）。
圖5. 肺動脈平滑肌細胞（而非內皮細胞）中過表達ALDH2可抑制HPH的發生
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