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維真腺相關病毒在腎病研究中的應用

研究背景
慢性腎臟病導致的腎纖維化是終末期腎衰竭（尿毒癥）的主要原因。研究表明，TGF-β1（轉化生長因子β1）信號通路在腎間質纖維化過程中起到重要作用，在TGF-β刺激下，Smad3（信號轉運蛋白）的磷酸化是整個TGF-β/Smad3通路活化的關鍵環節。過去的研究主要集中在關鍵蛋白編碼基因上，即傳統的關鍵基因突變導致其編碼的蛋白發生改變進而引起生物學功能的異常。然而，隨著分子生物學機制研究的發展，人們發現表觀遺傳學在腎臟間質纖維化的發展中同樣起著重要作用。
研究思路
研究者用TGF-β進行誘導，并通過高通量篩選技術，觀察腎小管上皮細胞中差異表達的長鏈非編碼RNA的表達，發現在TGF-β刺激下lnc-TSI的表達顯著增加。在生物學功能上，研究者發現Inc-TSI通過特異性抑制Smad3的磷酸化負向調控TGF-β/Smad3信號通路。分子機制研究發現，Inc-TSI可以通過結合Smad3的MH2結構域而阻止TGFβ I型受體和Smad3的結合。動物實驗表明，通過腺相關病毒AAV9實現人源基因lnc-TSI在小鼠腎臟中的過表達從而有效防治小鼠腎纖維化模型的發生發展。在慢性腎臟病人群的隊列研究中發現，在患者的腎臟活檢組織中，lnc-TSI的表達水平與腎間質纖維化的嚴重程度呈負相關。在長期隨訪、接受重復腎活檢的慢性腎臟病患者中，研究者發現首次腎活檢時腎臟lnc-TSI表達較低的患者，4年后腎纖維化和腎功能減退較lnc-TSI表達較高者更為嚴重。
病毒產品及使用方法
實驗結果分析
研究者采用單側輸尿管結扎（Unilateral Ureteral Obstruction, UUO）的方法，于術前一周進行小鼠腎靜脈原位注射。用生理鹽水將10μL腺相關病毒（AAV9-TSI，1×10E14 vg/mL）稀釋至100μL體積，每只小鼠使用100μL病毒稀釋液，于造模一周后處死小鼠。具體操作如下：使用動脈夾夾閉小鼠的腎靜脈，并用31G的針頭注射進入腎靜脈，保持夾閉15分鐘后松開。
圖1、 lnc-TSI在腎臟組織中的過表達。 Northern blot實驗證明，這種感染方法可以使lnc-TSI主要表達于腎臟中（1A）。同時，使用RNA原位雜交發現，病毒感染使lnc-TSI主要表達于腎皮質的腎小管上皮細胞中（1B），皮質中被感染成功的細胞百分比約為40-60%（1C&1D）。
圖2、腎臟組織中檢測lnc-TSI的表達和UUO所致的腎間質纖維化病變程度。Northern blot結果顯示，通過注射腺相關病毒AAV9-TSI可以成功在小鼠腎臟中表達lnc-TSI（2 B）。并且，在小鼠腎臟中特異過表達lnc-TSI可以有效減輕單側輸尿管結扎（UUO）所致的腎間質纖維化（2 C），表現為腎間質纖維化評分（TIF index）降低（2D）和腎小管中pSmad3蛋白的表達下降（2 E）。

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