AAV在腸道中的靶向策略
腸道是人體重要的消化器官和排毒器官，同時也是重要的免疫器官，有將近70%以上的免疫細胞分布在腸黏膜上，擔負著人體70%以上的免疫功能。腸道相關疾病發病機制的破解和治療所面臨的挑戰，使得研究腸道基因靶向技術研究迫在眉睫。雖然目前已有大量利用病毒載體進行基因轉移的臨床前數據，但在腸道中的研究仍然較少。
對于腸道的早期研究主要集中在粘膜轉導上，但由于腸道管腔條件惡劣及腸細胞代謝周轉率較高導致其成功率較低。重組腺相關病毒（rAAV）因其血清型種類多、表達時間長以及低免疫性的特點使腸道基因轉移的效率得到提高，但是如何提高AAV在腸道中轉導效率和特異性細胞靶向仍是腸道基因治療需要克服的障礙。
一、AAV血清型和啟動子的選擇
AAV2、AAV7、AAV8、AAV9和AAVrh10對腸道組織的轉導效率較高，其中AAV7對小腸的感染效率相對較高，AAVrh10已被證明能夠在腸道中長效表達外源基因，尤其是在結腸中，目前研究中應用較多的血清型是AAV9。腸道研究中，啟動子通常選擇廣譜型啟動子CMV。
圖1 SMA注射AAV后小腸（SI）結腸（Colon）中AAV血清型趨向性和轉導效率比較
圖2 AAV8、AAV9、AAV10注射后GFP熒光圖
（A、B：小腸，C、D: 結腸）
（Steven P , Annette M , Stacy P , et al. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2012.）
下表為AAV靶向腸道不同部位較優血清型和啟動子的總結：
（Buckinx R , Timmermans J P . Histochemistry & Cell Biology, 2016.）
二、注射方式和注射量
腸組織常見的注射方式有尾靜脈注射、腹腔注射、口服、灌腸和腸系膜上動脈（SMA）注射等。其中尾靜脈注射和腹腔注射作為系統性給藥方式，雖然操作簡單，損傷性小，但是注射量較大，特異性不強。口服和灌腸，都屬于腔內給藥，主要是黏膜的轉導，由于胃酸及腸蛋白水解酶等的中和作用，因此這兩種方式的轉導效率并不高。在這幾種注射方式中，SMA注射效果較好，但對實驗條件和操作手法要求較高，對小鼠傷害性也較大。口服和系統性注射的方式此處不進行贅述，下面分享灌腸和SMA注射的操作步驟供參考：
灌腸
(1)小鼠禁食過夜，并預先用N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）和毛果蕓香堿處理以促進腸道隱窩黏液排出。
(2)使用異氟醚將小鼠麻醉。
(3)在不使用鎮靜劑的狀態下，用1英寸不銹鋼的直圓針頭直腸注射300μL 20mM的NAC清洗結腸30min。
(4)再次麻醉小鼠，通過灌腸給予小鼠5*10E10vg，600μL體積量的AAV。
注：可通過直腸注射亞甲基藍觀察液體到達盲腸的預實驗，確定合適的灌腸液體積。
腸系膜動脈（SMA）注射
(1)將小鼠以右側臥位固定在手術板上，保持四肢松弛，放入含2-4.5% O2的異氟醚誘導室進行麻醉。小鼠深度麻醉后，將其放在手術臺上，對小鼠手術區域做去毛及消毒處理。
注：為保持小鼠體溫，可在手術板下放置加熱墊。整個手術過程在手術顯微鏡下放大5-40倍進行操作。
(2)手術開始前，皮下注射丁丙諾啡進行手術鎮痛；沿左腋線最后一個肋間隙和肋下區域注射布比卡因進行局部鎮痛。
(3)沿著腋線和側腹，在脾臟區域的左側皮膚上開一個1-2 cm的切口，切開腹外斜肌，使用微型牽引器將皮膚和腹壁固定，并用溫鹽水紗布覆蓋小腸防止縮回，暴露SMA。
(4)在放大20倍的情況下，將SMA輕輕地從腹膜后剝離，在SMA的近端接頭周圍放置一個小的穩定接頭連接注射針，使用微血管夾暫時切斷腹主動脈的血液供應。
(5)將定制33號1/2”針頭連接到250μL漢密爾頓TLL氣密性進樣針注射器上，輕輕插入SMA進行病毒注射（1*10E11vg, 200μL體積的AAV8）。將固定帶輕扎血管，防止注射部位泄漏。
注：注射過程中使用顯微鏡觀察以確保注射可視準確。
(6)注射后立即取下針頭，縫合注射部位。取下固定帶和微血管夾，使血液回流至小腸。使用無菌棉簽輕輕按壓注射部位進行止血。
(7)在腹腔內注射1mL無菌溫鹽水后，對小鼠進行縫合。
(8)術后每15min對小鼠進行一次監測，直到小鼠能夠腹臥。每2小時對動物進行一次監測，直至放回籠中。
圖3 小鼠SMA注射過程中顯微手術步驟的代表性照片
（Porvasnik S L , Mah C , Polyak S . Microsurgery, 2010.）
近幾年，隨著AAV在腸道基因轉移中的成功應用，研究人員對腸道相關疾病的發病機制和治療靶點的探究也有了新的突破。前期，我們已經為大家介紹了AAV在腸道中的應用策略（干貨篇），今天小V再帶大家一起學習一下維真AAV在腸道研究中的幾個應用實例。
客戶案例分享1
《Blocking IL- 17A enhances tumor response to anti- PD-1 immunotherapy in microsatellite stable colorectal cancer》
結直腸癌（Colorectal cancer，CRC）在所有癌癥類型中發病率排名第三，死亡率排名第二。雖然免疫檢查點抑制劑（Immune checkpoint inhibitors，ICIs）以及抗PD-1治療為CRC的治療帶來了曙光，但對微衛星穩定型（microsatellite stable，MSS）結直腸癌患者的治療非常有限，MSS CRC患者對ICIs的耐藥機制尚不明確。研究表明，白細胞介素17A（IL- 17A）與CRC患者的不良預后相關,并且其活性可能會導致抗腫瘤免疫的耐藥性，但阻斷IL- 17A是否能提高MSS CRC患者對ICIs的敏感性仍不確定。
在本研究中，作者首先對臨床病理標本進行評估并證實了PD-L1的mRNA水平與CD8+細胞浸潤和患者預后相關。在CAC（結腸炎相關腸癌）和APCmin/+CRC模型中，發現miR-15b-5p能在蛋白水平下調PD-L1的表達，抑制腫瘤發生，并增強腫瘤對抗PD-1的敏感性。使用細胞因子IL-17A處理CT26和MC38細胞后發現IL-17A通過調節P65/NRF1/miR-15b-5p通路導致直腸癌細胞中PD-L1高表達。進一步研究發現IL-17A和PD-1的聯合阻斷可以明顯減緩腫瘤生長，延長生存率。本研究提出IL- 17A有望成為增強MSS CRC患者對ICIs治療敏感性的靶點。
研究人員利用腺相關病毒（AAV-miR-15b-5p sponge）載體感染CAC和APCMin/+小鼠結腸組織，抑制miR-15b-5p的表達。作者觀察發現在CAC和APCMin/+結腸癌小鼠模型中，miR-15b-5p表達的阻斷明顯促進了腫瘤的發生，提高了PD-L1表達，同時顯著減少了CD8+細胞數量，說明miR-15b-5p通過靶向PD-L1抑制腫瘤的發生。
圖1. miR-15b-5p通過靶向PD-L1抑制腫瘤的發生
客戶案例分享2
《MiR155 Disrupts the Intestinal Barrier by Inducing Intestinal Inflammation and Altering the Intestinal Microecology in Severe Acute Pancreatitis》
胰腺感染是導致重癥急性胰腺炎（SAP）患者死亡的主要原因之一，研究認為腸道的微生態紊亂和炎癥導致腸道屏障破壞，致使腸道菌群移位進而感染胰腺。研究表明，miRNA通過塑造腸道菌群參與宿主免疫功能和炎癥的調控。miR155主要表達于胸腺和脾臟，被認為可能通過TLR通路參與腸道菌群介導的腸道免疫應答和腸道屏障破壞，具體作用機制尚需明確。
本研究探討了miR155對小鼠SAP相關腸道功能障礙的影響及其可能機制。通過建立SAP小鼠模型，研究人員發現miR155的過度表達導致SAP小鼠腸道組織損傷加重。采集盲腸組織進行16S rRNA基因測序，顯示miR155促進了腸道菌群的失調。進一步檢測發現miR155激活TLR4/MYD88通路，從而影響炎癥介質的釋放，調節SAP相關腸道損傷。對SAP小鼠進行miR155干擾（AAV9--miR155 sponge）后，腸道菌群失衡和腸道屏障相關蛋白的破壞得到了有效緩解，炎癥介質釋放減少，腸道組織病理損傷明顯改善。本研究結果表明，miR155可通過TLR4/MYD88通路加重腸道炎癥，破壞腸道屏障，顯著改變SAP小鼠的腸道微生態。
為檢測miR155在SAP小鼠腸道功能破壞中的作用，研究人員先利用AAV9載體對miR155進行了過表達及干擾處理，而后建立了SAP小鼠模型。檢測結果發現注射AAV9-miR155的小鼠小腸中miR155的表達量顯著升高，注射AAV9-miR155 sponge后miR155表達量明顯下降。miR155過度表達的SAP小鼠小腸組織損傷顯著增加，免疫組化檢測發現miR155的過表達明顯加劇了腸道屏障標志物ZO-1和E-cad的蛋白表達水平的下調。這些結果表明，miR155可能加劇了腸道屏障的破壞，下調miR155的表達可能對腸道屏障起到保護作用。
圖2. miR155可加重SAP小鼠腸道屏障的破壞
客戶案例分享3
《Arctigenin disrupts NLRP3 inflammasome assembly in colonic macrophages via downregulating fatty acid oxidation to prevent colitis-associated cancer》
牛蒡子苷元是牛蒡子的主要藥理活性成分，據報道有抑制腫瘤生長、緩解結腸炎的作用。目前牛蒡子苷元對結腸炎相關癌癥（colitis-associated cancer ，CAC）的保護作用及其機制尚不明確。本研究利用偶氮甲烷（AOM）/葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導CAC小鼠模型，發現口服牛蒡子苷元可以減緩CAC小鼠結腸炎的進展并預防結腸癌的發生。非靶向代謝組學技術測定發現，牛蒡子苷元下調巨噬細胞中NLRP3炎癥小體的激活和脂肪酸氧化（FAO）代謝。進一步研究發現牛蒡子苷元可以抑制肉堿棕櫚酰轉移酶1（CPT1）的表達，減少α-微管蛋白的乙酰化，破壞NLRP3復合物的形成，從而使NLRP3炎癥小體失活。牛蒡子苷元可以通過抑制小鼠NLRP3炎性小體激活并改善CAC，并且AAV9-CPT1的過度表達顯著降低了這種作用。本研究闡明了牛蒡子苷元主要通過下調結腸巨噬細胞中CPT1表達和隨后的NLRP3炎性小體激活發揮對CAC的保護作用，進而揭示了CPT1在炎性小體激活和結腸癌發生發展中的關鍵作用，同時也強調了牛蒡子苷元在降低結腸炎患者CAC風險方面的潛在價值。
為了確定牛蒡子苷元的抗CAC作用是否與CPT1介導的FAQ下調有關，研究人員使用AAV9作為載體，在CAC小鼠結腸組織中特異性過表達CPT1。結果發現CPT1過表達的小鼠在存活率、體重、結腸長度等方面都有顯著降低，且結腸組織腫瘤數量、負載量和大小均顯著增加。組織病理學檢查顯示CAC小鼠和CAC伴CPT1高表達組小鼠結腸粘膜內有大型腺癌。此外，上述兩組的小鼠表現出炎癥反應和隱窩減少癥狀，且CD68+ NLRP3+巨噬細胞數量顯著增加。CPT1過表達顯著增加了IL-1β的表達，同時也促進了結腸組織中α-微管蛋白乙酰化和乙酰輔酶A的產生。牛蒡子苷元對結腸巨噬細胞和CAC中NLRP3炎癥體激活的抑制作用隨著結腸組織中CPT1的過表達而逐漸消失，以上結果闡明了牛蒡子苷元主要通過下調結腸巨噬細胞中CPT1的表達和NLRP3炎性小體的激活來抑制CAC，同時也揭示了CPT1在炎癥小體激活和結腸癌發生進展中的作用。
圖3. CPT1過表達對牛蒡子苷元抑制小鼠結腸CAC和炎癥小體激活的影響
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圖4. AAV9注射小鼠結腸組織后免疫組化結果
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