AAV在胰腺研究中的靶向策略（干貨&應用合集）
胰腺是重要的分泌器官，由外分泌組織(腺泡)、內分泌組織(胰島)、胰管和血管組成，這些結構的功能障礙會導致不同的胰腺疾病發生。鑒于胰腺的解剖位置和復雜結構，胰腺疾病的基因治療需要針對不同胰腺部位進行有效的基因傳遞。多項研究表明，相比腺病毒和慢病毒而言，腺相關病毒更能有效轉導胰腺，已作為一種明星載體在胰腺研究中展開應用。今天小V就帶大家一起學習一下rAAV在胰腺基因工程中的選擇策略。
一、血清型的選擇
研究表明AAV8在胰腺中具有相對較高的轉導效率。
Cheng H等研究證明，AAV8對胰腺的轉導效率優于AAV1、AAV2、AAV5血清型，且持續表達時間較長（圖1）；進一步通過胰腺導管給藥觀察不同血清型的組織分布發現AAV8可以高效轉導胰腺組織（圖2），并且轉導效率呈劑量依賴式增加（圖3）。
圖1.不同AAV血清型和慢病毒對胰腺的轉導效率比較
病毒：ssAAV1、2、5、8，LV
啟動子：CMV
注射量：AAV：1011 VP；LV：1.5×107 IU
注射方法：胰腺導管給藥
（Cheng, H., et al. J Biomed Sci, 2007.）
圖2. 不同血清型AAV經胰腺局部給藥后的組織分布
病毒：ssAAV1、2、5、8
啟動子：CMV
注射量：1011 VP
注射方法：胰腺導管給藥
（Cheng, H., et al. J Biomed Sci, 2007.）
圖3. AAV1和AAV8對胰腺轉導的劑量反應
病毒：ssAAV1、8
啟動子：CMV
注射量：108-1011 VP
注射方法：胰腺導管給藥
· 維真AAV8感染小鼠胰腺效果圖 ·
（Insulin：紅色熒光 GFP：綠色熒光）
病毒產品：AAV8-insulin-GFP
病毒用量：1012 vg
注射方法：膽總管(十二指腸壺腹開口處)
二、AAV載體的選擇
研究表明scAAV對胰腺的轉導效率也較高，且不同血清型轉導效率與給藥方式、啟動子和注射量等密切相關。體外感染分離的胰島時，scAAV6的感染能力強于scAAV1、scAAV2和scAAV8；通過全身給藥時（腹腔體內注射），scAAV8比scAAV6轉導效率強（圖5）；而通過胰腺導管給藥時，scAAV6強于scAAV8、9，可以有效轉導腺泡、導管、胰島在內的多種胰腺細胞（圖6）。
圖5.不同血清型dsAAV-CB-GFP載體對體外胰島和體內胰腺的轉導效率比較
病毒：scAAV1、2、5、6、8
啟動子：CB
注射量：5×1011VG
注射方法：腹腔注射
（Wang, Z., et al. Diabetes, 2006.）
圖6.胰腺導管給藥時，scAAV6轉導效率強于scAAV8、9
病毒：scAAV6、8、9
啟動子：EF1α
注射量：1×1011VG
注射方法：胰腺導管給藥
（Quirin, K.A., et al.Mol Ther Methods Clin Dev, 2018.）
三、啟動子的選擇
為了在胰腺特定細胞中實現AAV介導的轉基因表達，可以選擇胰腺組織特異性啟動子，目前文獻中推薦的啟動子是胰腺β細胞特異性啟動子Insulin和PDX1，可以有效介導基因在胰腺β細胞的特異表達。
四、注射方式的選擇
在胰腺研究中，常用的給藥方有腹腔注射、靜脈注射和胰腺導管內注射。不同給藥方式會影響AAV載體對細胞的轉導能力。研究表明，與導管內給藥相比，ssAAV8和ssAAV9載體對胰腺的系統性給藥會導致其轉導率降低.（參考文獻“Safety and Efficacy of AAV Retrograde Pancreatic D)
因此，根據實驗目的選擇合適的注射方式十分重要。系統性給藥方式（腹腔注射和靜脈注射）的操作方式不再贅述，在此介紹一下胰腺導管內注射的操作方式（僅供參考）:
1、將小鼠進行麻醉后手術打開其腹腔，在膽囊底部切一小口，將特定的導管插入膽囊管中；
2、將導管置入總膽管，并在膽管和導管周圍用微鉗夾固定，以防止載體反流進入肝臟；
3、將微鉗夾置于Oddi括約肌上，避免載體漏入十二指腸，將100μl AAV載體通過導管緩慢注入胰管，腺體均勻腫脹則證明給藥成功；
4、灌注5min后取下上述兩個微鉗夾；
5、取出導管，手術縫合小鼠腹腔傷口。
6、術后，將小鼠放置在加熱墊上待其恢復后放回籠子。
· 總結 ·
在胰腺研究中，不同AAV血清型轉導效率與AAV載體選擇、啟動子以及給藥方式等因素密切相關：
①通過胰腺導管給藥方式，ssAAV8比ssAAV1、ssAAV2、ssAAV5轉導效率強；
②通過全身給藥，scAAV8比scAAV6轉導效率強；通過胰腺導管給藥方式時，scAAV6強于scAAV8、9；
③ssAAV8、9經胰腺導管給藥比經全身給藥轉導效率強。
小V建議您實驗前根據實驗目的綜合選擇合適的載體、血清型、啟動子和注射方式，以實現基因的高效長久表達。
客戶案例分享1
“Autotaxin signaling facilitates b cell dedifferentiation and dysfunction induced by Sirtuin 3 deficiency”（IF=6.448）
外周組織β細胞功能缺陷和胰島素抵抗是2型糖尿病（T2D）的主要病理生理學特征。β細胞去分化是導致β細胞功能缺陷進而促進T2D進展的因素之一。研究表明，控制β細胞去分化可作為改善β細胞功能的一種潛在治療策略。此外，多項研究證實胰島中SIRT3蛋白的表達與β細胞功能障礙密切相關。
先前的研究已發現，β細胞Sirt3特異性敲除的小鼠在HFD喂食后，糖耐量和胰島素分泌受損；胰島Sirt3缺失后Enpp2（又稱ATX）蛋白表達增強，Enpp2/ATX是一種具有溶血磷脂酶活性的分泌酶，可產生溶血磷脂酸(LPA)。在此研究中，作者假設ATX/LPA通路的激活促進了Sirt3缺陷β細胞的去分化，并將LPA或LPC（ATX可將其水解產生LPA）應用于Sirt3缺失的MIN6細胞系和小鼠胰島，以研究LPA對β細胞去分化的影響及其潛在機制。
研究顯示在Sirt3缺失的MIN6細胞和小鼠胰島中，ATX表達上調導致LPC增加，進而使LPA產生增加。LPA的增加不僅誘導了MIN6細胞和小鼠胰島的可逆去分化，而且還減少了葡萄糖刺激的胰島素分泌。機制上，ATX/LPA通過誘導JNK/p38 MAPK磷酸化促進β細胞脫分化。使用AAV8體內抑制ATX（AAV8-Atx-shRNA）可以改善HFD喂養的Sirt3缺失小鼠的胰島素分泌并減少β細胞的去分化。
圖7. Sirt3-ATX/LPA通路在胰腺β細胞去分化中的作用機制
基因信息：Atx，外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶蛋白家族成員
病毒產品：AAV8-Atx-shRNA、AAV8-scramble（insulin 1啟動子）
實驗動物：8周齡雄性小鼠
注射方式：腹腔注射
注射量：1×1012 genome copies
注射體積：100 μL
研究者使用腺相關病毒載體AAV8選擇性抑制了ATX在正常小鼠和Sirt3 f/f;Cre/+小鼠胰島中的表達。病毒注射8周后，進行6周的HFD喂食。胰島ATX蛋白水平的降低證明了AAV8病毒的有效傳遞。隨后的多項實驗測試表明胰臟β細胞中ATX的敲低不僅可以挽救HFD誘導的葡萄糖耐受不良，恢復胰島素的分泌，還減弱了HFD誘導的Sirt3 f/f;Cre/+小鼠中JNK/p38 MAPK信號的激活，抑制β細胞的去分化。這些結果證實了ATX在體內對β細胞去分化的病理作用。
圖8. Sirt3 f/f;Cre/+小鼠ATX的特異性敲低改善了HFD誘導的葡萄糖耐受不良
圖9. Sirt3 f/f;Cre/+小鼠ATX的特異性敲低改善了HFD誘導的β細胞去分化
案例分享2
“HRD1 an important player in pancreatic β-cell failure and therapeutic target for type 2 diabetic mice”（IF=9.461）
2型糖尿病(T2D)是一種以血糖持續升高為特征的慢性代謝性疾病，研究報道胰臟β細胞衰竭導致的胰島素分泌不足與T2D的發生發展密切相關。HRD1 (HMG-CoA reductase degradation 1)，是內質網應激相關E3泛素連接酶的代表，通過靶向并有效降解錯誤折疊的胰島素原維持胰島β細胞的功能，HRD1的缺失會導致胰島素分泌（GSIS）受損。研究報道HRD1在 Akita糖尿病小鼠胰島中表達上調。NCBI GEO數據庫的基因組數據顯示，T2D患者胰島細胞HRD1 mRNA水平升高。然而，HRD1在胰島β細胞中的特異性病理作用仍不明確。
大量的β細胞轉錄因子在成熟β細胞功能的維持中起著至關重要的作用，其中，轉錄因子v-maf 肌腱膜纖維肉瘤癌基因同源物A（MafA）僅在胰腺β細胞中表達，是β細胞形成和功能所需的關鍵因子。盡管泛素誘導的降解是糖尿病條件下β細胞中MafA減少的主要原因，但E3泛素連接酶在調節MafA活性中的具體作用仍有待探索。
在本研究中，研究者發現HRD1在T2D病人和T2D小鼠胰島中過度表達。功能研究表明，β細胞HRD1的特異性過表達引發了胰島素分泌受損，最終導致嚴重的高血糖;相反，在糖尿病模型中，HRD1基因的下調改善了血糖控制和反應。蛋白質組學分析表明HRD1與β細胞功能調控因子MafA可能存在相互作用。機制上，HRD1作為E3泛素連接酶，在糖尿病β細胞中靶向MafA的泛素化和降解，導致細胞質中MafA的積累，并降低其在細胞核中的生物功能，進一步導致β細胞功能障礙。本研究揭示了HRD1可作為2型糖尿病的治療靶點，確立了靶向HRD1對T2D治療的重要性。
基因信息：HRD1
病毒產品：AAV8-MIP–shHRD1–GFP、AAV8-MIP-HRD1-GFP、AAV8-GFP-control
病毒滴度：1012 GCP/mL
注射方式：胰腺導管內注射，6 μl/min
研究人員通過胰腺導管給藥AAV8-MIP-shHRD1-GFP，注射入雄性C57BL / 6J小鼠胰腺導管，特異性敲低小鼠β細胞中的HRD1，免疫熒光證實了AAV載體在體內的有效傳遞（圖10）。
圖10. 胰腺導管給藥AAV在體內的有效傳遞
隨后作者將AAV8-MIP-shHRD1注射入HFD飼喂的糖尿病小鼠胰腺導管，2周后，糖尿病小鼠空腹血糖明顯下降。4周后，糖耐量試驗（Intraperitoneal Glucose Tolerance Test，IPGTT）結果顯示糖尿病小鼠血糖反應和血清胰島素水平明顯改善。AAV-shHRD1注射db/db小鼠的葡萄糖反應也有改善。綜上結果表明HRD1在胰島β細胞功能障礙和糖尿病中發揮重要作用。
圖11. 抑制HRD1可改善糖尿病小鼠高血糖和葡萄糖耐受不良
研究人員通過胰腺導管內注射AAV8-MIP-HRD1，注射后胰島HRD1蛋白水平明顯升高，小鼠的空腹血糖和復餐血糖水平顯著升高，獲得β細胞HRD1特異性過表達小鼠。IPGTT結果顯示糖代謝嚴重受損，HRD1特異性過表達的小鼠血漿胰島素水平表現紊亂。上述結果表明β細胞HRD1上調可誘發高血糖并損傷胰島素的分泌。
圖12. HRD1過表達引發高血糖和葡萄糖耐受不良
案例分享 3
“Inhibition of miR-155 reduces impaired autophagy and improves prognosis in an experimental pancreatitis mouse model”（IF=8.469）
急性胰腺炎（AP）是一種胰腺炎癥疾病，其特征是蛋白酶異常激活、實質損傷、胰腺自消化、腺泡細胞凋亡和壞死以及強烈的炎癥反應。AP的早期階段，胰腺的損傷和炎癥會引起全身炎癥反應綜合征（SIRS），可導致單個或多個器官衰竭，這也正是AP早期發病和死亡的主要原因。然而，AP引起的器官衰竭的病理機制還尚未闡明。
MiR-155是一種在炎癥反應促進和抗炎通路激活抑制中發揮重要作用的miRNA，已有研究表明，miR155在胰腺炎樣本中表達上調。已知自噬受損可促進酶原激活、腺泡細胞分泌異常、細胞死亡和炎癥反應進而加重AP；此外，有研究表明miR-155在多種疾病中促進自噬。本研究旨在通過調節自噬探究miR-155對AP病程的影響。
基因信息：miR-155
病毒產品：AAV9-miR-155、AAV9-miR-155 sponge
注射體積：病毒稀釋液50 μL
注射方式：尾靜脈注射
檢測時間：注射3周后
首先，本研究構建了AP小鼠模型，利用AAV9載體介導miR-155和miR-155 sponge在AP小鼠胰腺中進行有效傳遞，發現miR-155靶蛋白TAB2的表達受到明顯調控。此外，miR-155表達的調節可以影響蛙皮素誘導的AP嚴重程度，進一步研究發現沉默miR-155可以抑制不能與溶酶體融合的自噬小體的積累，并通過靶向TAB2減少胰腺炎癥，從而改善AP模型小鼠的胰腺和肺損傷。此外，自噬抑制劑3-MA可以減少自噬小體的異常積累，從而減輕因miR-155水平升高而加重的胰腺損傷。本研究表明調節miR-155的表達可能是治療或預防胰腺炎的一種潛在策略。
圖13. AP中miR-155和自噬的調節機制
研究者通過小鼠尾靜脈注射AAV介導的miR-155和miR-155 sponge，3周后檢測miR-155的表達量，發現AAV9介導的miR-155在胰腺中有效傳遞，并且高滴度的AAV9對miR-155的表達影響更為顯著（圖14）。
圖14. AAV9介導的miR-155在胰腺中有效傳遞
進一步研究miR-155的調控對蛙皮素誘導的AP程度影響，通過胰腺水腫、炎癥細胞浸潤、腺泡細胞的病理改變以及淀粉酶和脂肪酶水平，發現上調miR-155可以加重蛙皮素誘導的AP嚴重程度，而下調miR-155可能對實驗性胰腺炎具有保護作用。
圖15. miR-155表達的調控影響蛙皮素誘導的AP嚴重程度
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