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肝臟作為較早被用于基因治療的器官，多年來研究熱度有增無減，前期小V已經與大家共同學習了在肝臟應用中關于AAV的選擇策略，今天小V將分享幾個利用維真生物AAV進行肝臟研究的文獻案例：
非酒精性脂肪性肝炎(NASH)相關的肝細胞癌和肝病已成為發達國家需要肝移植的主要原因。脂質過度積累導致的脂毒性能夠引起內質網應激和破壞蛋白質穩態，在NASH中發揮核心作用。目前還沒有批準任何藥物療法用于治療NASH，因此探究NASH的發展機制，尋找潛在的治療靶點至關重要。
在本研究中，為了確定減輕脂毒性有害后果的關鍵分子，作者進行了綜合多組學分析，確定了E3連接酶TRIM16為候選分子，進一步分析發現TRIM16在脂毒性反應中顯著上調，并且過表達TRIM16（AAV8腹腔注射）減輕了NASH小鼠模型的脂質積累和肝損傷。同時，作者還闡明了TRIM16調控NASH的機制，即TRIM16通過優先與磷酸化的TGF-β活化激酶 1 (TAK1) 相互作用并通過催化K48連接的泛素化促進其降解，來減弱絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK)信號通路的激活，進而抑制NASH的發展。總的來說，該研究表明TRIM16是一種特定的TAK1調節器，可以在NASH中作為潛在的治療靶標。
| 病毒產品 | AAV8-CMV-TRIM16&AAV8-CMV-GFP |
| 實驗動物 | 8周齡HFHC喂養C57BL/6J 小鼠（NASH小鼠模型） |
| 注射方式 | 腹腔注射 |
| 病毒滴度 | 1x10E13vg/ml |
| 檢測時間 | 8周后 |
如圖2所示，AAV8-TRIM16注射后，Western blot和qPCR分析均表明TRIM16在小鼠肝臟中過表達成功。與對照組(AAV-GFP)相比，注射AAV8-TRIM16的小鼠在經HFHC喂養16周后，肝臟重量和肝體重比明顯降低，此外，TRIM16過表達顯著減緩了HFHC喂養小鼠肝臟中的脂質積聚、炎癥、纖維化和肝損傷。
肝纖維化是一種慢性肝損傷，可導致肝硬化和肝癌。RNF20（環指蛋白20）又稱E3泛素蛋白連接酶BRE1A，已被報道參與慢性肝病，然而，RNF20在肝纖維化中的作用尚不清楚。研究人員先后通過肝纖維化模型的體內外研究證實，RNF20過表達可顯著抑制體內外肝纖維化的進展，表明RNF20有望成為治療肝纖維化的新靶點。
| 病毒產品 | AAV8-TBG-RNF20 |
| 實驗動物 | C57BL/6J小鼠 |
| 注射方式 | 尾靜脈注射 |
| 病毒滴度 | 7.94×10E13 vg/ml |
| 注射量 | 1×10E9pfu/mouse |
| 檢測時間 | 8周后 |
為探究RNF20在肝纖維化中的作用，研究人員建立了活體肝纖維化模型，如圖3所示，使用AAV8過表達RNF20顯著逆轉了小鼠肝組織中由CCl4引起的炎性浸潤和膠原體積，同時逆轉CCl4導致的α-SMA的表達增加和H2BK120ub蛋白水平的降低，這些結果表明，RNF20過表達可明顯減輕體內肝纖維化癥狀。
肝纖維化是一種慢性肝損傷的傷口愈合反應，其特征是細胞外基質(ECM)在肝臟過度沉積，最終導致肝功能喪失和肝臟結構破壞。研究表明，趨化因子受體系統在肝臟疾病的發病機制中起著關鍵作用，C-C基序趨化因子受體2(CCR2)被認為是治療肝纖維化很有前景的一個靶點。PC3分泌微蛋白(PSMP)/微精原蛋白(MSMP)是一種新型的趨化細胞因子，作為CCR2配體可以募集外周血單核細胞和淋巴細胞，可能影響炎癥和癌癥的發展。
首先，研究者通過免疫組織化學檢測了不同肝臟疾病組織中的PSMP水平，發現PSMP在肝纖維化患者肝組織中表達較高。接著，構建了PSMP敲除小鼠（PSMP-/-小鼠）,發現PSMP-/-小鼠血清丙氨酸轉氨酶(ALT)水平明顯降低，肝損傷得到改善。利用AAV8載體在PSMP-/-小鼠過表達hPSMP，發現肝損傷和纖維化顯著加重；并通過構建PSMP和CCR2雙敲除小鼠模型發現PSMP過表達以CCR2依賴的方式促進肝纖維化的發展。作者揭示了PSMP通過促進炎癥巨噬細胞浸潤、M1極化、促炎細胞因子產生以及通過CCR2直接激活肝星狀細胞進而加速肝纖維化，提出PSMP可能是一個潛在的肝纖維化治療靶點，其抗體可能是治療肝纖維化的潛在藥物。
| 基因信息 | hPSMP（人類PC3分泌型微蛋白，一種新型的趨化細胞因子，受體為CCR2） |
| 病毒產品 | AAV8-hPSMP&AAV8-null |
| 實驗動物 | 6-8周齡C57BL/6J雄性小鼠 |
| 注射方式 | 尾靜脈注射 |
| 注射劑量 | 100μL，2×10E11vg |
| 檢測時間 | 8周后 |
通過尾靜脈注射AAV8-hPSMP后，PSMP-/-小鼠肝臟PSMP表達量顯著升高，注射4周后PSMP依舊有較高的表達。接著再用CCl4處理以誘導肝纖維化，發現PSMP過表達引起的肝損傷和纖維化顯著加重，并通過構建PSMP和CCR2雙敲除小鼠模型發現PSMP過表達以CCR2依賴的方式促進肝纖維化的發展。
類泛素化修飾（Neddylation）是一種通過將NEDD8與特定底物蛋白中的賴氨酸共價結合，控制細胞的生存和增殖的泛素化樣途徑。但是，類泛素化在哺乳動物代謝中的生理作用尚不明確，也沒有明確的線粒體靶點。肝臟特異性UBA3缺乏會導致類似戊二酸尿癥II型（GA-II）的系統性異常，GA-II是一種罕見的常染色體隱性遺傳性脂肪酸氧化障礙疾病，由線粒體電子轉移黃素蛋白（ETF:ETFA和ETFB）或相應的泛醌氧化還原酶缺陷引起。然而ETFA和ETFB蛋白水平在轉錄后水平調控的機制尚不清楚。
在本研究中，作者構建的肝臟特異性UBA3和NEDD8缺失的小鼠模型，表現出自發性脂肪肝和肝細胞衰老的新生兒死亡，并伴有肝臟脂肪酸-β氧化缺陷；成年小鼠中UBA3的特異性缺失（通過AAV-DJ進行尾靜脈注射）導致ETF蛋白的減少，并增加禁食誘導的脂肪變性和死亡率。IB和IF分析發現新生小鼠線粒體蛋白也發生類泛素化，免疫共沉淀分析發現ETF蛋白為類泛素化的底物。此外，ETF基因突變導致類泛素化修飾缺陷，促進了GA-II的發病。本研究表明類泛素化修飾是一種可以通過阻斷肝細胞內ETFs的泛素化和降解來靶向并穩定ETFs的泛素化樣修飾途徑，肝類泛素化可防止新生小鼠出現GA-II類異常，降低成年小鼠因禁食引起的死亡率。
| 病毒產品 | AAV-DJ-CAG-Cre |
| 實驗動物 | 8周齡C57BL/6J雄性小鼠 |
| 注射方式 | 尾靜脈注射 |
| 注射量 | 20 μL |
| 病毒滴度 | 3.0×10E13vg/ml |
| 檢測時間 | 6周后 |
如圖6A所示，研究人員將AAV-DJ-CAG-Cre通過尾靜脈注射至8周齡雄性Uba3F/F和同窩Uba3F/+ 小鼠體內，IB分析證實Uba3F/F小鼠肝臟中UBA3缺失，但心臟和腎臟中沒有，證明肝臟特異性UBA3缺失小鼠模型構建成功。經AAV-DJ-Cre轉導后，Uba3F/F小鼠和Nedd8F/F小鼠肝臟中UBA3、Nedd8的缺失導致ETFs蛋白表達水平的顯著下降；對小鼠進行禁食處理，研究者發現UBA3、Nedd8的缺失導致小鼠肝臟脂質儲存和死亡率增加，表明成年小鼠肝臟中的類泛素化/ETF軸可以預防禁食誘導的脂肪變性和死亡率。
肝臟有很強的再生能力，許多肝臟疾病的治療都是通過有效的肝再生來調節的。但是，調控肝再生的生物學機制仍不清楚。研究表明，溴域和末端外結構域(BET)蛋白及其抑制劑與肝癌密切相關，此外BET蛋白在斑馬魚的肝再生過程中至關重要，但具體的機制仍需進一步探究。Hippo-YAP/TAZ通路已被證實是調節細胞增殖和器官大小的關鍵因子，在多種肝疾病中處于激活狀態，但其是否參與肝再生過程也尚不明確。
在本研究中，作者發現BET蛋白抑制劑JQ1顯著抑制70%肝臟切除術（PH）后的肝再生，并且JQ1可以抑制肝臟細胞的增殖。進一步檢測發現JQ1在mRNA和蛋白水平抑制體內肝再生過程YAP/YAZ和Notch信號通路的表達，而YAP/TAZ抑制劑顯著下調了YAP、TAZ和Notch信號通路相關基因的表達，并抑制70%PH后肝再生。接著利用AML12-Yap-shRNA細胞系證明了JQ1可以通過抑制AML12細胞YAP的表達，間接下調Notch信號通路的活性，下游分子Notch1被證明是YAP/TAZ的功能靶標。最后發現通過過表達YAP可以補救BET蛋白抑制劑引起的肝再生損傷，揭示了YAP/TAZ–Notch1–NICD在肝再生中的功能以及BET蛋白抑制劑（如JQ1）在肝臟疾病治療中的風險。
| 基因信息 | YAP（Hippo/Yes-associated protein，Hippo/Yes相關蛋白，被認為是調控肝臟大小的重要因子） |
| 病毒產品 | AAV9-CMV-YAP |
| 實驗動物 | 6周齡C57BL/6J雄性小鼠 |
| 注射方式 | 腹腔注射 |
| 注射劑量 | 1×10E11 vg/mice |
| 檢測時間 | 4周后 |
腹腔注射表達YAP的AAV9過表達載體，發現YAP顯著高表達。與YAP非過表達組相比，YAP過表達后小鼠LW/BW比、肝再生的兩個關鍵調節因子Hgf和Vegf表達水平及Notch信號通路相關蛋白（Jagged1, Notch1和NICD）表達水平均明顯升高。不僅如此，Ki-67（細胞增殖指數）陽性肝細胞數量也遠遠高于YAP非過表達組。這些數據說明，小鼠肝臟中YAP的過表達可以挽救BET蛋白抑制劑對肝再生的損傷。
