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肝臟是較早被用于基因治療的器官，現已明確許多肝病是由單基因缺陷引起，因此相比其他由多基因缺陷引起的復雜疾病更適合開展臨床基因治療。肝靶向基因治療面臨的挑戰在于肝細胞的有效靶向、載體基因組的穩定性和持續的高水平表達，rAAV載體的出現及使用使這一難題的解決成為可能。今天小V就帶大家一起學習一下rAAV在肝臟應用中的相關選擇策略。
Vol.1
AAV血清型的選擇
在肝臟中應用較多的有AAV2、AAV5、AAV8、AAV9及AAV-DJ等血清型，研究表明AAV8、AAV9和AAV-DJ對肝臟均具有較強的親嗜性，其中AAV8嗜肝性更強，用于活體動物注射表現為免疫原性低，感染效率高，AAV-DJ的體內肝細胞轉導效率與AAV8相近，且在體外實驗中也能表現出較強的感染效率。
研究者還可根據實驗目的及動物模型的不同選擇不同的血清型，其中AAV7、AAV8對小鼠肝臟感染具有較好效果；而在人體肝臟中AAV2、AAV5和AAV8親和性較強。
如下圖所示：無論是選用門靜脈還是尾靜脈注射，AAV8均能有較高的肝臟轉導水平
| 種類 | AAV血清型推薦 |
|---|---|
| 小鼠肝臟 | AAV7、AAV8 |
| 高等靈長類動物肝臟 | AAV2、AAV5、AAV8 |
Vol.2
啟動子的選擇
在肝臟中，廣譜型啟動子CMV即可高效表達，也可以選擇肝臟特異啟動子增強組織靶向性，如ALB、TBG和ApoEHCR-hAAT，其中TBG應用較多。
| 啟動子 | 啟動子 | 大小 |
|---|---|---|
| 廣譜啟動子 | CMV（常用） | 600bp |
| CAG | 944bp | |
| 特異性啟動子 | ALB（較大） | 2.4Kb |
| TBG（常用） | 460bp | |
| ApoEHCR-hAAT | 1.3Kb |
Vol.3
常用的肝臟注射方式
肝臟對全身應用AAV有較高的親合性，AAV在肝臟中的注射方式分為直接傳送和外周傳送兩種（下表所示），其中尾靜脈注射和腹腔注射是目前應用比較廣泛的注射方式，操作者也可根據實驗目的選擇合適的注射方式。
| 注射方式 | 覆蓋 | 優點 | 缺點 |
|---|---|---|---|
| 直接傳送 | 肝葉注射、門靜脈注射、脾包膜注射；肝動脈注射（大動物與人）； | 克服了轉導效率低的問題，靶向性高，所需病毒量少； | 侵入性強，風險大，實驗操作技能要求高； |
| 外周傳送 | 腹腔注射和靜脈注射（尾靜脈注射和眶后靜脈竇注射等）； | 操作簡單，無須手術或麻醉； | 靶向性較直接傳送稍差，可能需要較多的注射體積； |
在此，我們介紹一下幾種常用的注射方式，肝門靜脈注射、肝實質內注射、尾靜脈注射以及新生小鼠靜脈注射的操作步驟供大家參考。
1. 肝門靜脈注射
（1）通過腹腔注射麻醉劑將成年小鼠麻醉，對小鼠腹部局部區域做去毛及消毒處理；
（2）在距劍突軟骨下方2-3mm處，做一個2-3cm的中線切口。
（3）暴露門靜脈，使用30G針頭在1min內均勻緩慢注射0.2 ml病毒懸液。
注：門靜脈是一種相對較大的靜脈，提起肝前葉一般即可看到門靜脈。在手術過程中，用浸泡在生理鹽水中的無菌紗布覆蓋腸道，保持腸道濕潤。
（4）注射后保持針位約10-20秒。取出針后，做好防出血處理；
（5）縫合腹部，將小鼠放置于加熱燈下，直至恢復意識。然后將其放回籠子單獨飼養，直到傷口完全愈合。
2. 肝內注射
（1）通過腹腔注射麻醉劑將成年小鼠麻醉，對小鼠腹部局部區域做去毛及消毒處理；
（2）在距劍突軟骨下方2-3mm，做一個2-3cm的中線切口，以露出肝臟。
（3）用固定在結核菌素注射器上的30G針頭將病毒懸液緩慢注入肝實質中。
注:在注射過程中通過手術立體鏡監測注射部位，確保無出血或外滲。如果出現上述任何一種情況，需取出針頭，輕輕按壓止血，然后選擇一個新的部位進行注射。
（4）取出針，用無菌紗布輕輕按壓止血。
（5）再選擇其他部位進行注射。
注：一只成年小鼠一次可選擇4 ~ 5個不同的注射位點(40 ~ 50μl/site)，總劑量可達200μl。
（6）縫合腹部，將小鼠放置于加熱燈下，直至恢復意識。然后將其放回籠子單獨飼養，直到傷口完全愈合。
3. 尾靜脈注射
（1）將小鼠放在標準限制器中，使注射器能夠完全接觸到整個尾巴長度。
（2）將一根30G的針頭固定在1cc結核菌素注射器上，盡可能遠的插入尾部側面靜脈。選擇一個遠端部位，如果第一次注射失敗，可以選擇另一個更近端的注射部位。
注：a：小鼠尾巴上較容易接觸到的靜脈位于尾巴的側面，且側靜脈非常淺，無需進針很深；小鼠尾部背面的靜脈很難常規注射；尾部腹面的血管是動脈，不可注射。
b：注射前用溫水輕輕地加熱尾巴，可以使血管得到一定程度的舒張，便于注射。
（3）針頭到位后，緩慢注射病毒懸液。
（4）注射完成后取下針頭，輕輕按壓止血，然后立即將小鼠放回籠中。
注：使用此方法注射成年小鼠，病毒用量控制在300 - 400μl較佳。
4. 新生小鼠靜脈注射
（1）需兩個人配合完成，一人固定，一人注射；
（2）注射前將小鼠置于干毛巾上，減少活動及損傷；
（3）一人輕輕固定小鼠，使側面朝上，暴露眼睛至頸部的顳淺靜脈，置于放大鏡下；
（4）另一人沿著自頭至頸的方向將30G的注射針頭插入靜脈旁的皮下，慢慢推進靜脈（新生鼠皮膚呈現半透明，較易觀察）；
（5）慢慢注射病毒懸液；（如果注射成功，注射部位遠端靜脈會呈白色，如果未成功，皮下注射10μl即可看到明顯的隆起）
（6）注射完成后，取下針頭，輕輕按壓靜脈，通常2-3分鐘會停止出血；
（7）將新生鼠在加熱燈下照射后，放回母鼠身邊；
（8）如果注射不成功，讓小鼠恢復5-10分鐘，然后在另一側嘗試第二次注射；
注：使用此方法注射新生小鼠，病毒用量控制在100μl以內較佳。
Vol.4
總結
在應用AAV進行肝臟研究時，可以選擇靶向性更強的肝門靜脈注射或肝實質內注射方式，如果實驗技能受限或減少侵入性損傷，也可以選擇尾靜脈注射等實驗技能要求稍低的給藥策略，在這種情況下，就可以配合AAV8等肝臟嗜性較強的血清型以及TBG等肝臟特異性啟動子提高AAV對肝臟的感染效率，以達到理想的實驗效果。
Vol.5
參考文獻
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AAV在肝臟研究中的靶向策略【應用篇】（可點擊查看）
