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『糖尿病治療新靶點』南京大學韓曉教授團隊發現HRD1——T2D治療新靶點！

背景介紹

糖尿病（diabetes）是一種以葡萄糖和脂肪代謝紊亂、血漿葡萄糖水平升高為主要臨床特點的代謝性疾病，長期的高血糖，導致各種組織，特別是眼、腎、心臟、血管、神經的慢性損害、功能障礙。糖尿病主要分為四類：1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠期糖尿病和特殊類型糖尿病，以2型糖尿病（type 2 diabetes, T2D）最為常見。1型或2型糖尿病均存在明顯的遺傳異質性。1型糖尿病有多個DNA位點參與發病，其中以HLA抗原基因中DQ位點多態性關系最為密切。2型糖尿病已發現多種明確的基因突變，如胰島素基因、胰島素受體基因、葡萄糖激酶基因、線粒體基因等。

2020年，南京醫科大學韓曉教授研究團隊在《Diabetes 》上發表的“HRD1 an important player in pancreatic β-cell failure and therapeutic target for type 2 diabetic mice”論文研究表明胰島β細胞中HRD1的特異性過表達引發胰島素分泌受損，最終導致嚴重高血糖。該研究成果發現HRD1可作為2型糖尿病的治療靶點，使人類在治療T2D方面又取得新進展！

HRD1 (HMG-CoA reductase degradation 1)，是內質網應激相關E3泛素連接酶的代表，通過靶向并有效降解錯誤折疊的胰島素原維持胰島β細胞的功能，HRD1的缺失會導致胰島素分泌（GSIS）受損。研究報道HRD1在 Akita糖尿病小鼠胰島中表達上調。NCBI GEO數據庫的基因組數據顯示，T2D患者胰島細胞HRD1 mRNA水平升高。然而，HRD1在胰島β細胞中的特異性病理作用仍不明確。

研究結果分享

1.糖尿病人及小鼠胰腺β細胞HRD1表達升高

 通過Western blot、qRT-PCR和免疫熒光染色方法，作者發現：① db/db和HFD飼料喂養的糖尿病小鼠胰島中HRD1顯著上調；② T2D患者分離的胰島也得到了類似的結果；③db/db和HFD飼喂的小鼠胰腺β細胞內質網HRD1顯著升高，伴隨胰島素水平的顯著降低；④ 長期暴露于高糖環境的人及小鼠胰島細胞HRD1表達較正常組明顯上調；⑤ 在慢性高糖處理的人胰島初級β細胞中HRD1表達增強。綜上所述，糖尿病人及小鼠胰腺β細胞HRD1表達水平升高，可能與β細胞的衰竭和糖尿病的發生有關。

圖1. HRD1在糖尿病人及小鼠胰島β細胞中表達升高

2. 抑制HRD1改善糖尿病小鼠的血糖控制和血糖反應

作者將AAV-MIP-shHRD1-GFP（維真生物提供）注射入雄性C57BL / 6J小鼠胰腺導管，特異性敲低小鼠β細胞中的HRD1。免疫熒光觀察顯示AAV病毒在體內有效傳遞。

隨后作者將AAV8-MIP-shHRD1（維真生物提供）注射入HFD飼喂的糖尿病小鼠胰腺導管，2周后，糖尿病小鼠空腹血糖明顯下降。4周后，糖耐量試驗（Intraperitoneal Glucose Tolerance Test，IPGTT）結果顯示糖尿病小鼠血糖反應和血清胰島素水平明顯改善。AAV-shHRD1注射db/db小鼠的葡萄糖反應也有改善。綜上結果表明HRD1在胰島β細胞功能障礙和糖尿病中發揮重要作用。

圖2. 抑制HRD1可改善糖尿病小鼠高血糖和葡萄糖耐受不良

3. HRD1過表達致胰島素分泌受損和血糖升高

作者胰腺導管內注射AAV8-MIP-HRD1（維真生物提供），注射后胰島HRD1蛋白水平明顯升高，小鼠的空腹血糖和復餐血糖水平顯著升高，獲得β細胞HRD1特異性過表達小鼠。IPGTT結果顯示糖代謝嚴重受損，HRD1特異性過表達的小鼠血漿胰島素水平表現紊亂。上述結果表明β細胞HRD1上調可誘發高血糖并損傷胰島素的分泌。

圖3. HRD1過表達引發高血糖和葡萄糖耐受不良

4. HRD1和MafA在細胞中的表達水平呈負相關

 為了確定HRD1高表達引起的β細胞胰島素分泌受損的分子基礎，作者通過質譜分析研究Ad-HRD1 或 Ad-GFP感染后MIN6細胞HRD1的結合蛋白，發現其中一種蛋白細胞特異性轉錄因子MafA與碳水化合物刺激反應有關，免疫沉淀分析證實HRD1和MafA共存于沉淀復合物中，當HRD1高表達時，HRD1和MafA的相互作用增強，在人胰島證實HRD1和MafA之間呈負相關。MafA是β細胞功能和健康的積極指標，HRD1過表達在翻譯水平而非轉錄水平上顯著降低了MafA的表達。

圖4. HRD1和MafA直接相互作用，在細胞中表達水平呈負相關

 免疫沉淀分析證實HRD1和MafA同時存在于沉淀復合物中，HRD1和MafA之間呈負相關作用，當HRD1高表達時，二者的相互作用增強。此外，HRD1過表達在翻譯水平而非轉錄水平上顯著降低了MafA的表達。

5. HRD1通過抑制MafA表達致胰島素分泌受損

 作者研究發現單獨感染Ad-HRD1的小鼠胰島和MIN6細胞，胰島素分泌明顯被抑制，這種抑制可通過補充MafA得以恢復。敲除HRD1可有效減輕因暴露于慢性高糖環境而導致的小鼠胰島和MIN6細胞MafA的減少。小鼠胰島細胞和長期暴露高糖環境的MIN6細胞HRD1敲除后，葡萄糖或KCL刺激的胰島素分泌也得到了恢復。HFD飼喂的小鼠和db/db小鼠，AAV-shHRD1注射4周后，胰島MafA表達水平也出現反彈。綜上所述，HRD1高表達通過下調MafA使β細胞發生功能障礙。

圖5. HRD1高表達通過下調MafA導致胰島素分泌受損

6. HRD1導致MafA在細胞質積累，并削弱其核轉錄調節活性

 在HRD1過表達時，在MIN6細胞及HEK293A細胞，MafA和HRD1定位于細胞核周圍而不是細胞核，主要在ER區域共定位，表明HRD1在ER附近捕捉MafA，通過其胞質C端結構域與胞質MafA相互作用。熒光素酶報告基因檢測，作者發現HRD1過表達顯著降低MafA的核轉錄調控活性，qPCR和ChIP-qPCR結果證實胰島素是MafA調控的主要基因。HRD1的敲低部分挽救了糖脂毒性條件下核MafA的減少，表明HRD1的降低足以維持核MafA水平。HRD1不僅調節細胞內MafA的數量，而且調節其在β細胞中的定位。

圖6. HRD1誘導MafA細胞質聚集，削弱其在細胞核中的功能

7. HRD1作為E3泛素連接酶降解MafA

 HRD1泛素連接酶的活性離不開其Ring環域內的第291位半胱氨酸，作者測量了HRD1- WT及C291S突變體HRD1 (HRD1- C291S)對MafA泛素化的影響，發現HRD1- WT過表達顯著增加MafA泛素化；HRD1下調可顯著降低慢性高糖處理MIN6細胞MafA的泛素化，HRD1的缺失抑制高糖環境下MafA蛋白的快速降解，并恢復MIN6細胞總MafA蛋白的下降。上述結果表明HRD1是E3泛素連接酶，其作用是負責MafA的泛素化和降解。

圖7. HRD1靶向MafA進行泛素化并將其降解

小結

 本研究揭示HRD1作為E3泛素連接酶介導MafA的泛素化和降解，它的失調(缺失或過量)可導致胰島β細胞功能衰竭，在糖尿病的發病機理中起著重要的作用。針對HRD1靶向治療可提高MafA的蛋白水平，改善β細胞功能，治療2型糖尿病。

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參考文獻

 1. Hu Y, Gao Y, Zhang M, Deng KY, Singh R, Tian Q, Gong Y, Pan Z, Liu Q, Boisclair YR,Long Q. 2019. Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation (ERAD) Has a Critical Role in Supporting Glucose-Stimulated Insulin Secretion in Pancreatic beta-Cells. Diabetes 68: 733-46 .

 2. Meier, J.J., [Treatment of type 2 diabetes]. Internist (Berl), 2016. 57(2): p. 153-65.