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AAV在心臟研究中的靶向策略【應用篇】

 通過上一期AAV在心臟研究中的靶向策略（干貨篇）對rAAV在心臟實驗中的啟動子、血清型以及注射方式的選擇策略的學習，相信大家對rAAV在心臟研究中的應用已有所了解，今天小V將和大家一起，通過幾個案例深入了解一下關于AAV在心臟研究中的具體應用。

維真客戶AAV心臟注射實例 01
Zinc finger and BTB domain-containing protein 20 aggravates angiotensin II?induced cardiac remodeling via the EGFR?AKT pathway

ZBTB20（鋅指和BTB結構域蛋白20）是來自POK家族的轉錄因子，被證明在維持心臟收縮中發揮關鍵作用，但在心臟重構中的作用尚未被闡明。本研究中，作者用血管緊張素II（Ang II）誘導小鼠心臟重塑模型，探討ZBTB20在心臟重構中的作用。研究發現ZBTB20在Ang II誘導的心臟重塑和心肌細胞損傷反應中表達升高；AAV9（心肌注射）介導的ZBTB20過表達，可導致心壁肥厚、心室擴張、纖維化增加和射血分數降低，而敲低ZBTB20后可保護心肌細胞免受Ang II誘導的肥大影響。從分子機制來看，ZBTB20通過EGFR-Akt信號通路加重Ang II誘導的心臟重塑反應，本研究闡明了ZBTB20在不良心臟重構向心力衰竭的轉變中的作用，并為誘導不良心臟重構的分子機制提供了依據。

如圖1所示，使用AAV9病毒載體在小鼠心臟中過表達ZBTB20， ZBTB20-NS組和ZBTB20-Ang II組ZBTB20蛋白表達水平均明顯升高，并且ZBTB20-Ang II組的ZBTB20蛋白表達水平高于ZBTB20-NS組。Ang II處理四周后，ZBTB20注射組較NC組心肺重量更高，同時小鼠左心室和心肌細胞肥大增加，這提示ZBTB20組出現心肌肥大和肺水腫。此外,多種不良心臟重構和纖維化分子標志物轉錄增加，血管周圍和間質纖維化變得更為嚴重，這些數據表明ZBTB20的過表達促進了不良的心臟重構發展為心力衰竭。

圖1. ZBTB20的過表達加重了心臟重構

如圖2所示，使用AAV9 RNA干擾ZBTB20，WB檢測到ZBTB20蛋白水平大大降低。小鼠心肌細胞經轉染ZBTB20 siRNA后肥大反應明顯降低，而且細胞表面積變小，心臟重構分子標志物Anp和β-Mhc的轉錄水平也有所降低，表明敲低ZBTB20可保護心肌細胞免受Ang II誘導的肥大影響。

圖2.敲低ZBTB20可保護心肌細胞免受Ang II誘導的肥大影響

維真客戶AAV心臟注射實例 02
MiR-590-5p inhibits pathological hypertrophy mediated heart failure by targeting RTN4

 由各種心臟疾病導致的心力衰竭（HF）是造成當今社會人群死亡的主要原因之一，目前尚無特別有效的治療方法，尋找新的標志物對HF的診斷和治療具有重要意義。前期研究發現miR-590-3p可顯著增加幼鼠及成年大鼠心肌細胞的增殖，并且在肺動脈高壓兒童患者上腔靜脈血液中表達上調。網狀內皮素4（RTN4）被證實在肥厚性心肌病動物模型中顯著上調，同時參與冠心病調控，可作為心衰的指標。此外，RTN4還是miR-590-5p的預測下游靶點。基于這些研究結果，研究人員探索了miR-590-3p和RTN4在HF中的關系。

研究人員采用主動脈弓縮窄術制備小鼠HF模型，并對小鼠心力衰竭的的病理進程進行分析觀察，發現miR-590-5p在HF小鼠心臟組織中表達下調,尾靜脈注射AAV9-miR-590-5p可減輕心肌肥厚和心肌細胞凋亡。此外，miR-590-5p過表達可促進H9C2細胞活力，抑制細胞凋亡，降低心肌重塑水平。機制上，miR-590-5p結合到RTN4 3 'UTR，通過負調控RTN4 調節心肌細胞表型。綜上所述，miR-590-5p通過下調RTN4調控HF心肌肥厚和心肌細胞凋亡。

如圖3所示，通過RT-qPCR驗證AAV9-miR-590-5p在小鼠中的表達大幅提高。miR-590-5p的過表達降低了小鼠LVEDD（左心室舒張末期內徑），減輕了小鼠心肌的水腫和肥厚。此外，miR-590-5p的過表達還顯著降低了小鼠心臟組織ANF、BNP和β-MHC(心臟重構標志物)的蛋白水平，同時使Bcl-2（細胞凋亡抑制基因）蛋白水平升高及Bax（細胞凋亡促進基因）蛋白水平降低。綜上所述，miR-590-5p過表達可減輕HF模型小鼠的心肌肥厚和心功能障礙。

圖3. MiR-590-5p過表達可減輕HF模型小鼠的心肌肥厚和心功能障礙

維真客戶AAV心臟注射實例 03
The deubiquitinase UCHL1 regulates cardiac hypertrophy by stabilizing epidermal growth factor receptor

 病理性心臟肥大可導致心力衰竭。研究證實在促心肌肥厚途徑中表皮生長因子受體（EGFR或ErbB1）是正調控因子，EGFR的穩定性、轉運和激活主要受翻譯后修飾的調控，然而其具體調控機制尚不完全清楚。研究表明去泛素化酶UCHL1在心肌梗死后的心肌細胞中表達高度上調，但是人們對其在調節心肌肥厚和重構中的作用知之甚少。

在本研究中，研究者通過功能缺失和功能獲得的方法并使用抑制劑，證實UCHL1在激動劑誘導的心肌肥厚細胞及衰竭心臟中表達上調，過表達UCHL1（AAV9，尾靜脈注射）可加速壓力超負荷誘導的心肌肥厚，而下調UCHL1則可顯著改善由激動劑或壓力超負荷引起的心肌肥厚；同時闡明了UCHL1通過降低EGFR泛素化和降解正向調節心肌肥厚，全身給藥UCHL1抑制劑可顯著逆轉心肌肥厚和重構。綜上所述，這些發現表明UCHL1在心肌肥厚的發病機制中發揮重要作用，可作為肥厚治療的靶點。

如圖4所示，利用AAV9載體在小鼠心臟中過表達UCHL1，熒光顯微鏡檢測顯示心臟細胞得到高效感染，免疫印跡分析顯示心臟中UCHL1蛋白水平大大提高。

圖4. AAV9在小鼠心臟內高效傳遞

 與rAAV9-GFP對照組相比，UCHL1的過表達導致TAC術后小鼠發生更嚴重的心功能障礙，且死亡率明顯增加。此外在UCHL1表達增加的同時，EGFR蛋白水平、小鼠心肌中磷酸化的EGFR、AKT和ERK1/2（促心肌肥厚因子）也顯著升高，表明心臟中過表達UCHL1可加重心肌肥厚，并可能與EGFR的穩定性有關（圖5）。

圖5. 過表達UCHL1可加速TAC術后小鼠的心肌肥厚

維真客戶AAV心臟注射實例 04
Oleic Acid Attenuates Ang II (Angiotensin II)-Induced Cardiac Remodeling by Inhibiting FGF23 (Fibroblast Growth Factor 23) Expression in Mice

 高血壓可損傷多種靶器官，研究表明在輕度至中度高血壓人群中左心室肥厚（LVH）患病率為20%至50%。然而，高血壓心臟重構的病理機制仍知之甚少。油酸（OA）是一種重要的單不飽和脂肪酸，據報道富含OA的地中海飲食可降低心血管在內的多種疾病的發生率，但其在高血壓性心臟重塑中的作用及機制尚不清楚。

 本研究中作者對OA在高血壓性心臟重塑中的作用進行了探討。通過檢測伴有和不伴有LVH高血壓患者的血漿代謝譜，研究人員發現伴LVH高血壓患者的外周血中OA水平顯著降低，并先后通過體外及體內研究證實OA可顯著降低Ang II(血管緊張素II)誘導的心肌細胞生長、心肌成纖維細胞膠原表達和小鼠心臟重塑。RNA測序進一步發現FGF23(成纖維細胞生長因子23)在Ang II誘導反應中表達顯著上調，而在OA處理后表達明顯受抑。利用AAV9載體過表達FGF23可加重Ang II誘導的心臟重塑，并削弱OA對心臟重塑的保護作用，進一步研究發現OA通過阻斷Nurr1(核受體相關蛋白)從細胞質到細胞核的易位抑制Ang II誘導的FGF23表達，深入揭示了OA在防止Ang II誘導的心臟重塑中發揮關鍵作用。

通過尾靜脈注射將AAV9-FGF23及AAV9-GFP載體注入小鼠體內，熒光顯微鏡及WB檢測顯示AAV9病毒高效傳遞至小鼠心臟，FGF23蛋白在心臟組織中成功過表達（圖6）。FGF23在心臟組織中的過表達加重了Ang II誘導的心功能障礙，并損害了OA對心臟重構及心肌纖維化的保護作用。

圖5. 過表達UCHL1可加速TAC術后小鼠的心肌肥厚

圖6. AAV9注射3周后小鼠心臟組織熒光結果及FGF23蛋白水平檢測

維真客戶AAV心臟注射實例 05
Redd1 protects against post?infarction cardiac dysfunction by targeting apoptosis and autophagy

 心肌梗死（MI）是全球發病率和死亡率最高的心臟疾病之一，梗死后會發生心肌重塑并可能導致心力衰竭。目前，藥物干預仍是預防梗死后心臟重塑和功能障礙的有效治療方法，因此，尋找有效的干預靶點，減輕心肌梗死后心臟重構，從而防止梗死后患者心力衰竭的發展是至關重要的。據報道，細胞凋亡和自噬參與心肌組織發生的生理過程，而且哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)被證實在許多心臟病中可同時調節凋亡和自噬相關的發病機制，但其具體調控機制尚不清楚。發育及DNA損傷反應調節基因1（Redd1）參與mTOR活性調節，但其在心臟中的作用知之甚少。

 在本研究中，作者首先檢測了MI小鼠心臟中Redd1的表達情況，發現Redd1表達量下調。進一步使用AAV9介導Redd1過表達發現Redd1的過表達改善了小鼠左心室功能障礙，降低了擴張指數，并抑制了心肌細胞凋亡及改善了自噬。此外，研究發現過表達Redd1可以抑制mTOR及其下游效應蛋白的磷酸化，進而緩解缺血損傷引起的心室功能障礙。綜上所述，本研究證明Redd1過表達通過mTOR信號通路減少細胞凋亡和增強自噬來保護心肌梗死后心力衰竭的發生和持續，深入揭示了Redd1是心肌梗死后心力衰竭發展的治療靶點。

研究人員通過尾靜脈注射AAV9載體上調Redd1的表達，發現小鼠心肌細胞中Redd1表達量顯著上升。Redd1的過表達顯著降低了LVEDd和LVESd，大大提高了LVEF 和LVFS水平，并使ANP和BNP mRNA水平大幅下降，同時β-MHC mRNA水平也略有下降。總的來說，Redd1過表達在心肌梗死后對心功能障礙和心臟擴張有保護作用。

圖7. Redd1過表達可預防心肌梗死后心功能不全

維真客戶AAV心臟注射實例 06
Downregulation of miR-146a Contributes to Cardiac Dysfunction Induced by the Tyrosine Kinase Inhibitor Sunitinib

 舒尼替尼（SNT）等酪氨酸激酶抑制劑可以顯著提高癌癥患者的預期壽命，但是這些藥物的使用可能會引發心臟收縮功能障礙、高血壓、慢性心力衰竭等心血管方面的不良反應。然而，這種作用的分子機制仍然不清楚。MicroRNA是心血管疾病和酪氨酸激酶途徑中的關鍵調控因子，已被證實在心血管疾病中發揮著關鍵作用。MicroRNA的過表達和下調可能是治療心臟病患者的一種有效方法。

 研究人員使用miRNA芯片分析了舒尼替尼處理后小鼠心肌中miRNA的差異表達，發現miR-146a顯著下調。利用熒光素酶報告基因檢測實驗證實miR-146a的下游靶點為Pln和Ank2，二者與心臟收縮功能障礙密切相關。體內外實驗結果表明SNT下調miR-146a的表達，并通過調控下游靶點PLN和ANK2導致心臟收縮功能障礙，上調miR-146a可緩解SNT對心臟收縮力的抑制作用。本研究揭示了miR-146a可能是一種有效的SNT誘導的心臟功能障礙的保護劑。

如圖8所示，研究人員使用心臟特異性啟動子cTNT驅動的AAV9載體在小鼠心臟特異表達miR-146a，不同組織的熒光圖像表明，靜脈注射病毒載體后僅心臟被高效感染。通過超聲心動圖檢測心臟收縮功能，結果表明心臟中miR-146a的過表達顯著抑制了SNT誘導的EF和FS降低，表明心臟功能得到改善。

圖8. 體內過表達miR-146a可減輕SNT誘導的心肌收縮功能障礙