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想要基因在腦區高效轉導?這些點你要get到!

在神經科學研究中,尤其是在體實驗,通常利用腺相關病毒(AAV)工具載體研究基因在神經系統中的功能作用,原因在于相較于其他基因運載工具,AAV病毒具有免疫原性低、安全性好并能實現基因的長效表達等優點。

前期,我們為大家介紹了在神經系統研究中常用且好用的血清型,您可以根據具體的實驗目的和方案要求選擇適合的血清型(),那么在選擇好合適的血清型以后,還有哪些可以優化和考慮的因素呢?如何才能驅動目的基因在腦區的高效轉導?今天我們和大家一起來學習一下。
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AAV載體的選擇

腺相關病毒為單鏈DNA病毒(ssAAV), 在入核、脫衣殼后,需要借助宿主DNA聚合酶或者分子間退火完成雙鏈轉化,才能啟動基因轉錄過程,這一過程限制了AAV載體介導的基因轉導,并直接影響病毒的感染效率。自身互補雙鏈 DNA 的腺相關病毒(scAAV)能夠克服這一限制,不需要經歷一個由單鏈變為雙鏈的過程,也就是說,雙鏈AAV病毒進入細胞后,可以直接表達,并且表達時間更快,表達水平更高。因此,在神經研究中,您也可以根據需要選擇scAAV載體,完成目的基因更快表達,或者基因更強表達的研究。

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ssAAV & scAAV


啟動子的選擇

根據啟動子的表達特征,我們通常將啟動子分為組成型啟動子、誘導型啟動子以及器官/組織特異性啟動子,這些啟動子各具特色。神經系統的組成及其復雜,腦部的精密研究非常關鍵。要想實現某個腦區甚至是某一類細胞特異性感染,選擇一種特異性相對更強的啟動子尤為重要。

組成型啟動子

一般來自于管家基因,可連續不斷地啟動基因的表達。如巨細胞病毒啟動子CMV、CMV增強子融合的雞?-肌動蛋白啟動子CAG或泛素C啟動子UBC等等。

誘導型啟動子

只有在一定的外界誘導或刺激作用下才能啟動基因的表達,如四環素啟動子TRE。

器官/組織特異性啟動子

只有在特定的器官/組織中才能啟動基因的表達,下圖為大家列出的是一些常見的神經組織特異性啟動子:

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轉錄后調控元件的添加

除了啟動子外,AAV載體上其他元件的使用與優化也非常關鍵,尤其是轉錄后調控元件的添加,對于mRNA的剪接及核輸出、mRNA的穩定性及翻譯等具有重要意義,下面列舉兩個對于提高外源基因表達非常重要的轉錄后調控元件。

內含子

真核mRNA內含子在真核生物基因表達調控中起著重要的作用,是轉基因研究中提高外源基因表達的重要元件之一。在多數情況下,真核mRNA內含子的存在可以提高基因的表達水平,因為其剪接過程會影響mRNA新陳代謝的多個階段,包括轉錄、RNA編輯、pre-mRNA的加工、mRNA的出核運輸、翻譯等。所以說,在載體容量允許的情況下可添加一個內含子,有助于刺激基因的表達。

WPRE元件

土撥鼠肝炎病毒轉錄后調節序列WPRE是一段順式作用的RNA元件,放在多聚腺苷酸化信號之前可顯著增加mRNA的表達水平和翻譯效率,進而增強基因的表達,并且WPRE插入病毒載體中還可以大大提升病毒包裝的滴度。然而由于WPRE序列較長(600bp左右),所以還需要視具體的載體容量選擇性插入。


AAV注射方式的選擇

目前AAV在神經系統研究中的注射方法主要有3種:腦定位注射、靜脈注射和腦脊液注射,每種注射方式各有優缺點,研究者可根據具體的研究對象以及實驗方案,選擇適合的注射方式,推薦進行預實驗對實驗

效果做初步測試,以得到更優的選擇方案。

結語

值得注意的是,除了以上所述各項因素外,AAV病毒本身的滴度和純度,目的基因本身的自然屬性(如胞內蛋白/分泌蛋白/轉運蛋白)以及AAV感染后所使用的檢測方法等因素也會影響到基因最終的表達效果。因此,在神經系統研究中,想要驅動更高效的基因轉導,可以綜合考慮以上各項因素,優化選擇。



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