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睡眠是生命所需。人一生中有將近1/3的時間處于睡眠狀態。睡眠質量的好壞與人體健康密切相關。睡眠障礙會引起負面情緒，嚴重時會引發重大精神疾病。但是人為什么需要睡眠？熬夜后為什么睡得更沉、更香？睡眠到底是如何被調控的呢？一系列科學問題尚待解決。
人體內有兩大系統會引發睡意：睡眠穩態與晝夜節律。晝夜節律是通過內在的生物鐘控制一天中睡眠覺醒的時間；睡眠穩態則主要是由睡眠壓力進行調控，睡眠壓力的累計程度控制機體的睡眠量。先前研究已鑒定了許多睡眠穩態因子和生物學過程。其中，基底前腦（basal forebrain，BF）腺苷的釋放是睡眠穩態的重要生理調節因子。腦內與睡眠覺醒相關的神經核團有很多，BF是調控該周期的一個重要核團。BF內含有膽堿能、谷氨酸能和GABA能多種類型神經元，這些神經元活動如何調控腺苷的釋放仍是一個謎。
近日，北大李毓龍課題組與中科院腦智卓越創新中心徐敏課題組合作在《Science》發表了題為《Regulation of sleep homeostasis mediator adenosine by basal forebrain glutamatergic neurons》的研究論文。該項研究利用新型遺傳編碼的高靈敏性、高特異性和高時間分辨率的腺苷探針，聯合運用光纖記錄、光遺傳學和細胞特異損毀技術揭示了BF谷氨酸能神經元在調控腺苷動態變化和睡眠穩態中的關鍵作用，進一步闡明了睡眠穩態調控的神經環路機制，為探索睡眠障礙的治療方法提供了重要參考。
為了高特異性和高時間分辨率檢測睡眠覺醒周期中BF胞外腺苷濃度的動態變化，李毓龍教授組開發了腺苷探針（GRABAdo），該探針的檢測原理是基于腺苷G蛋白偶聯受體的激活，使胞外腺苷的濃度通過綠色熒光蛋白的熒光強度來測量。作者從靈敏性、特異性和胞內信號通路的偶聯等方面分別進行了實驗，發現迭代優化后的GRABAdo1.0（簡稱Ado1.0）具有較高的靈敏性和特異性，同時與胞內信號通路具有微乎其微的偶聯，對細胞生理無明顯影響（圖1）。
據睡眠中腦電圖表現、眼球運動情況和肌張力變化，睡眠可分為非快速眼球運動睡眠 (NREMS)和快速眼球運動睡眠(REMS)兩種時相。其中，REMS由于持續時間短，傳統的微透析無法記錄腺苷濃度的變化。腺苷探針的高時間分辨率使問題得到了有效解決。作者使用AAV2/9-hsyn-GRABAdo1.0-mScarlet和AAV2/9-hsyn-GRABAdo-mut腦立體定位注射小鼠BF并測量熒光信號。為了排除運動噪音，作者將Ado1.0與紅色熒光蛋白mScarlet融合表達，該紅色熒光蛋白對腺苷濃度的變化不敏感。實驗結果顯示：小鼠BF胞外腺苷濃度的變化順序為：快速眼動睡眠階段>覺醒階段>非快速眼動睡眠階段(后2個階段的結果跟傳統微透析的結果一致)。而且，當小鼠在這三種狀態間轉換時，腺苷濃度的變化相對較快。胞外腺苷濃度的快速變化揭示其釋放可能依賴于神經活動（圖2）。
先前已有研究表明，BF膽堿能神經元（ChAT+）和谷氨酸能神經元（VGLUT2+）在覺醒和REMS階段非常活躍，而且利用光遺傳學技術激活這兩類神經元可以促進機體覺醒。因此，作者首先通過檢測ChAT+神經元活動與胞外腺苷濃度變化的相關性研究了BF ChAT+神經元的作用。作者利用“兩側雙探針”法將AAV2/9-hsyn-GRABAdo1.0和AAV2/9-EF1α-DIO-GCaMP6s分別注入ChAT-Cre小鼠大腦半球兩側BF，2周后測定熒光信號，實驗數據表明，ChAT+神經元鈣活動與胞外腺苷濃度的變化高度相關，且鈣活動通常早于腺苷信號變化~24 s，表明BF ChAT+神經元可能調控胞外腺苷的濃度變化。
接著，作者將AAV2/9-hsyn-GRABAdo1.0和AAV2/9-hSyn-FLEX-ChrimsonR-tdTomato 混合注射ChAT-Cre小鼠BF，光遺傳激活ChAT+神經元，利用光纖記錄腺苷的釋放量。ChAT+神經元的激活引起胞外腺苷小幅顯著增加，表明ChAT+神經元可調節睡眠覺醒周期中胞外腺苷濃度的變化。但是，誘發腺苷濃度變化的幅度在不同試驗中有較大差異，表明BF中可能存在其它類型神經細胞調節睡眠覺醒周期中胞外腺苷濃度的變化（圖3）。
隨后，作者采用同樣的“兩側雙探針”法又進一步研究了BF VGLUT2+神經元的調節作用。實驗數據表明，BF VGLUT2+神經元中的鈣活動與胞外腺苷濃度變化高度相關，且早于腺苷信號~41s。光遺傳激活VGLUT2+神經元可引起胞外腺苷濃度大幅增加，并且高于激活ChAT+神經元所引起的胞外腺苷濃度，這表明VGLUT2+神經元對調節睡眠覺醒周期中胞外腺苷濃度的變化貢獻更大。
接下來，作者用Caspase-3特異損毀BF VGLUT2+神經元，測量腺苷濃度的變化。將AAV2/9-hsyn-GRABAdo1.0和AAVDJ-flex-taCasp3-TEVp混合注射VGLUT2-Cre小鼠BF，兩周后觀察到BF VGLUT2+神經元數量顯著減少。與對照組相比，實驗組小鼠BF胞外腺苷濃度的增加在覺醒和REM階段顯著減少。上述結果進一步證明BF VGLUT2+神經元對胞外腺苷濃度增加起重要調節作用（圖4）。
最后，作者通過細胞特異性損毀驗證了BF中VGLUT2+神經元的缺失會影響小鼠睡眠穩態。與對照組相比，BF VGLUT2+神經元缺失的小鼠在覺醒狀態下的時間明顯更長，且這種差異主要表現為小鼠在夜晚清醒度增加。
作者又檢測了BF VGLUT2+神經元的缺失是否會影響睡眠恢復。亮燈6h使老鼠保持清醒狀態，隨后18h內進行恢復性睡眠。實驗組小鼠NREM睡眠明顯減少，并且NREM睡眠時間下降速度明顯加快。上述結果表明BF VGLUT2+神經元的缺失影響了小鼠的睡眠穩態（圖5）。
此研究中，作者開發了一種新型的高靈敏度、高特異性和高時間分辨率的腺苷探針（GRABAdo），通過結合光遺傳學操作和細胞特異損毀技術，闡明了睡眠覺醒周期中小鼠基底前腦谷氨酸能神經元調節胞外腺苷濃度變化，積累睡眠壓力，從而對睡眠穩態具有重要調節作用。該研究為機體在清醒狀態下神經活動通過刺激促眠因子的釋放而增加睡眠壓力的機制提供了新的見解。
原文鏈接：
| AAV病毒 | AAV2/9-hsyn-GRABAdo1.0-mScarlet; AAV2/9-hsyn-GRABAdo1.0 ; AAV2/9-hsyn-GRABAdo-mut; |
| 注射動物 | 7周齡以上雄性和雌性小鼠 |
| 注射體積 | 0.2 ~ 0.4 μl |
| 注射方式 | 腦立體定位注射 |
| 注射位置 | 基底前腦 |
| 檢測時間 | 2周 |
| 探針類別 | 病毒名稱 |
|---|---|
| 膽堿類 | 乙酰膽堿探針 |
|
AAV9-hSyn-GACh2.0 |
|
|
AAV9-TRE-GACh2.0 |
|
| AAV9-hSyn-ACh3.0(ACh4.3) | |
| AAV9-CaMKII-ACh3.0(ACh4.3) | |
| AAV9-GfaABC1D-ACh3.0(ACh4.3) | |
| …… | |
| 嘌呤類 | 腺苷探針 |
|
AAV9-hsyn-Ado1.0(B10) |
|
| AAV DJ-hsyn-Ado1.0(B10) | |
| AAV9-EFS-DIO-Ado1.0 | |
| AAV9-GfaABC1D-Ado1.0 | |
|
AAV9-hsyn-Ado1.0mut(B10-F168A) |
|
| …… | |
| 腺苷三磷酸探針 | |
| AAV9-hsyn-ATP1.0(B09) | |
| AAV DJ-hsyn-ATP1.0 | |
| AAV9-EFS-DIO-ATP1.0 | |
| AAV9-GfaABC1D-ATP1.0 | |
| AAV9-hsyn-ATP1.0mut(B09 N283A) | |
| …… | |
| 生物胺類 | 多巴胺探針 |
|
AAV9-hSyn-DA1h(DA4.2) |
|
|
AAV9-hSyn-DIO-DA1h(DA4.2) |
|
|
AAV9-hSyn-DA1hmut(DA4.2mut) |
|
| AAV9-TRE-DA1hmut(DA4.2mut) | |
| AAV9-CaMKII-DA1h(DA4.2) | |
| …… | |
| 五羥色胺探針 | |
| AAV9-hsyn-r5HT1.0 | |
| AAV9-CAG-r5HT1.0 | |
| AAV9-hsyn-r5HT2.0 | |
| AAV9-hsyn-5HT2.1(renamed as 5-HT1.0) | |
| AAV9-hsyn-DIO-5HT2.1(renamed as 5-HT1.0) | |
| …… | |
| 組胺探針 | |
| AAV9-hsyn-HA1.0h (His1.0) | |
| AAV9-hsyn-HA1.0mut (His1.0mut) | |
| AAV9-hsyn-HA1.0m (His1.0M) | |
| AAV9-hsyn-DIO-HA1.0h | |
| AAV9-hsyn-HA1.0h-mScarlet | |
| …… | |
| 去甲腎上腺素探針 | |
|
AAV9-hsyn-NE1m(NE2.1) |
|
|
AAV9-hSyn-DIO-NE1m(NE2.1) |
|
|
AAV9-hSyn-NEmut(NE2.1mut) |
|
|
AAV9-TRE-NE1m(NE2.1) |
|
| AAV9-hsyn-mRuby3-NE1m(NE2.1) | |
| …… | |
| 神經肽類 | 血管活性腸肽探針 |
| AAV9-hsyn-VIP1.0 | |
| AAV9-hsyn-DIO-VIP1.0 | |
| …… | |
| 神經肽Y探針 | |
| AAV9-hsyn-NPY1.0 | |
| AAV9-EF1a-DIO-NPY1.0 | |
| …… | |
| 神經降壓肽探針 | |
| AAV9-hsyn-NTS1.0 | |
| …… | |
| 膽囊收縮素 | |
| AAV9-hsyn-CCK2.0 | |
| AAV1-hsyn-CCK2.0 | |
| AAV9-hsyn-DIO-CCK2.0 | |
| …… | |
| 促腎上腺皮質激素釋放激素探針 | |
| AAV9-hSyn-CRF3.0 | |
| AAV9-EFS-DIO-CRF3.0 | |
| AAV9-CaMKII-CRF3.0 | |
| AAV9-hSyn-CRFmut | |
| AAV9-EFS-DIO-CRFmut | |
| …… | |
| 精氨酸血管加壓素探針 | |
| AAV9-hsyn-AVP2.0 | |
| AAV9-hsyn-DIO-AVP2.0 | |
| …… | |
| 催產素探針 | |
| AAV9-hSyn-OXT1.0 | |
| AAV9-EFS-DIO-OXT1.0 | |
| AAV9-hSyn-OXTmut | |
| AAV9-EFS-DIO-OXTmut | |
| …… | |
| 生長激素抑制素探針 | |
| AAV9-hsyn-SST2.0 | |
| AAV9-hsyn-DIO-SST2.0 | |
| …… | |
| 其他 | 大麻素AEA探針 |
| AAV9-hsyn-AEA1.0 | |
| …… | |
| 內源性大麻素eCB探針 | |
| AAV9-hsyn-eCB2.0 | |
| AAV9-hsyn-DIO-eCB2.0 | |
| AAV9-hsyn-eCB2.0mut | |
| AAV9-hsyn-DIO-eCB2.0mut | |
| AAV9-GfaABC1D-eCB2.0 | |
| …… | |
| 褪黑素探針 | |
| AAV9-hsyn-MT2.0 | |
| …… | |
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