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大腦是人體中樞神經系統中最高級的部分，是思維的器官，是心智和意識的物質本體，也是結構最復雜、功能最完善的器官，其對生命之重毋庸置言。雖然近幾十年神經科學得到了快速的發展，然而，時至今日大腦仍屬于人類知之甚少的人體構造之一。
腦行使功能的結構基礎是神經環路，那么如何解析大腦不同腦區、不同類型神經元之間神經環路的結構和功能呢？神經示蹤技術是帶領我們探索大腦功能的工具之一。傳統的神經示蹤技術存在諸多缺點，如無法實現細胞特異性標記、無法攜帶基因、信號衰減等。作為新興神經示蹤工具的病毒載體為這些問題的解決提供了新方案，是目前最為有效、應用最廣的示蹤工具。基于噬神經病毒發展來的狂犬病毒(RV)和偽狂犬病毒(PRV)是成熟的、廣泛使用的跨突觸逆向病毒示蹤劑；而基于噬神經病毒發展來的單純皰疹病毒(HSV)和水皰性口炎病毒(VSV)可以實現跨突觸順向標記，但是其神經毒性和跨突觸不可控，限制了其在解析神經環路研究中的應用，因此，這迫切需要我們尋找一種優良的跨突觸順向病毒示蹤劑。
除噬神經病毒外，AAV近年也被用于環路示蹤，因為AAV具有復制缺陷性和極低的免疫原性，不會造成大量的神經毒性。大部分的研究使用AAV進行非跨突觸標記。2014 Castle等人發現AAV1可順向示蹤神經元，但是其潛在跨突觸的證據還不清楚并存在爭議。直到2017年，南加利福尼亞大學的 張礪教授帶領的團隊在《Neuron》發表的“AAV-Mediated Anterograde Transsynaptic Tagging: Mapping Corticocollicular Input-Defined Neural Pathways for Defense Behaviors”，首次證實了AAV可順向跨單級突觸傳導，研究表明高滴度的AAV2/1-hSyn-Cre能有效、特異跨單級突觸標記神經元及其輸出，這為利用順向跨突觸病毒工具研究大腦復雜功能提供了可能性。
今天小V和大家分享AAV順向跨突觸傳導的最新研究成果。
2020年4月，張礪教授帶領的團隊又在《The Journal of Neuroscience》發表題為“Synaptic Specificity and Application of Anterograde Transsynaptic AAV for Probing Neural Circuitry”的論文，深入研究了AAV病毒順向跨突觸傳導的突觸特異性和在多種神經環路中的廣泛應用。
解剖結構的研究結果如下圖：在Ai14 x GAD67-GFP 小鼠的腦橋核PN和下橄欖核IO分別注射scAAV1-hSyn-Cre，發現小鼠的來自PN的投射標記出小腦大量的顆粒細胞GCs，而小鼠的來自IO的投射標記出小腦中的浦肯野細胞PCs，從而證實了AAV順向跨突觸傳導可特異性標記突觸后的細胞群。
進一步研究了AAV順向跨突觸傳導的突觸特異性的功能特征(見下圖)。將scAAV1-hSyn-Cre和AAV1-EF1a-DIO-ChR2-YFP 1:1混合注射入Ai14 小鼠初級視覺皮層V1，只有共轉這2種病毒的神經元才能表達ChR2，采用全細胞記錄技術，藍光誘發突觸前神經元興奮，產生動作電位，動作電位傳導到突觸后神經元也可以產生神經沖動，發現其功能性連接的下丘神經元IC被標記，且在TTX和4-AP存在的時候沒有變化。證明AAV1更傾向于標記注射點下游突觸連接的神經元。
作者探究了AAV1從突觸末端釋放的機理（見下圖）。將AAVDJ-CMV-TeNT-P2A-GFP ( AAV1-hSyn-GFP 作為對照) 注射入Ai14小鼠的初級視覺皮層V1。14天后在同一腦區注射入scAAV1-hSyn-Cre，并在2周后檢測上丘SC中 tdTomato+細胞數目。結果顯示：TeNT組跨突觸標記tdTomato +細胞數目較對照組減少約94%。TeNT可通過切割VAMP2從而完全阻斷Ca2+誘發的突觸囊泡融合和神經遞質的釋放，從而證實了AAV的傳導明顯依賴于突觸囊泡的釋放。
抑制性神經環路中的研究結果見下圖。將scAAV1 - hSyn - Cre注射到紋狀體Str中，Str中含有GABA能棘狀神經元，它可以投射到黑質網狀核SNr中的抑制性細胞。14天后，發現SNr中的神經元被標記；此外，作者還測試了AAV1從SNr中的抑制性神經元擴散到丘腦腹內側核VM中的興奮性神經元的概率，發現VM中也有相當數量的神經元被標記，證明AAV1可以用于抑制性神經元投射順向跨突觸標記不同類型的多種細胞。
神經調質神經環路中的研究結果見下圖。將scAAV1-hSyn-Cre注射入Ai14 小鼠斜帶核NDB、背側中縫核DR和藍斑LC中，14天后，發現其投射的下游腦區神經元被稀疏或者零標記。證明AAV1順向跨突觸標記能力在神經調質能的神經環路中的應用比較局限：在谷氨酸和γ氨基丁酸神經環路中，AAV1具有高效的順向跨突觸標記能力；而乙酰膽堿、五羥色胺和去甲腎上腺素神經環路中則顯得極其遜色。
腦-脊髓投射神經環路中的研究結果見下圖。將scAAV1-hSyn-Cre注射入Ai14 小鼠的初級運動皮層Mop-II、初級軀體感覺皮層SSP-II、外側下丘腦LHA、紅核RN中，14天后，發現脊髓頸椎、胸椎和腰椎處神經元被不同程度標記，證明AAV1在腦-脊髓投射神經環路中具有順向跨突觸標記能力，為進一步研究腦-脊髓投射神經環路功能奠定了基礎。
通過比較不同AAV血清型和嗜神經病毒，發現AAV1具有順向跨突觸標記能力，然而AAV1的順向跨突觸標記能力非常弱，需要聯合重組酶系統(如Cre or Flp)進行放大，從而啟動轉基因的強表達。相比AAV1-hSyn-Cre，scAAV1-hSyn-Cre表現出了更優越的順向跨突觸標記能力：本研究從解剖、功能和分子層面深入研究了AAV1順向跨突觸傳導的突觸特異性，并闡述了其作用機制整體上依賴于突觸囊泡的釋放；scAAV1-hSyn-Cre可在興奮性、抑制性、神經調質和腦-脊髓等多種神經環路中有效、特異地標記單突觸靶神經元及其輸出，從而解析不同的功能/行為。總之，scAAV1-hSyn-Cre具有有效、特異跨突觸標記能力，鑒于其同時具有低概率的逆向示蹤能力，它僅適用于精確標記單向神經環路，通過與其它技術(如轉基因動物和稀疏標記等)的聯合運用可以滿足神經研究人員的多種實驗需求。
本文獻中的部分AAV病毒由維真生物提供，如下表所示：
| 病毒名稱 |
|---|
| scAAV1 hSyn-Cre |
| AAV1 hSyn-Flp |
| AAVretro-hSyn-Cre |
| AAV1-EF1a-DIO-Flp-WPRE |
| AAVretro-hSyn-GFP-WPRE |
下表所示為維真生物多種AAV產品，如有需要，歡迎致電400-077-2566！
| 產品編號 | 產品名稱 |
|---|---|
| Cre/Flp | |
| AV204006-AV1 | AAV1-hSyn-Cre |
| AV204046-AV1 | scAAV1-hSyn-Cre |
| AV204006-AV2 retro | AAV2 retro-hSyn-Cre |
| AV204049-AV1 | AAV1-hSyn-Flp |
| AV204050-AV1 | AAV1-CAG-DIO-Flp |
| AV204054-AV1 | AAV1-EF1a-DIO-Flp |
| …… | |
| 產品編號 | 產品名稱 |
|---|---|
| 熒光蛋白（標記神經元） | |
| AV200001-AV2 retro | AAV2 retro-CMV-GFP |
| AV200007-AV2 retro | AAV2 retro-hSyn-GFP |
| AV200109-AV1 (Cre依賴) | AAV1-CAG-DIO-GFP |
| AV200160-AV2 (Cre依賴) | AAV2-CAG-DIO-mCherry |
| AV200145-AV9 (Cre依賴) | AAV9-EF1a-DIO-mCherry |
| AV200096-AV2 (Cre依賴) | AAV2-hSyn-DIO-GFP |
| AV200096-AV9 (Cre依賴) | AAV9-hSyn-DIO-GFP |
| AV200146-AV9 (Cre依賴) | AAV9-hSyn-DIO-mCherry |
| AV200117-AV9 (Cre依賴) | AAV9-CaMKIIa-DIO-GFP |
| AV200147-AV5 (Cre依賴) | AAV5-CaMKIIa-DIO-mCherry |
| AV200147-AV9 (Cre依賴) | AAV9-CaMKIIa-DIO-mCherry |
| …… | |
| 光遺傳學(操控神經元) | |
| AV201006-AV2 (Cre依賴) | AAV2-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-mCherry |
| AV201006-AV9 (Cre依賴) | AAV9-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-mCherry |
| AV201007-AV2 (Cre依賴) | AAV2-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP |
| AV201007-AV9 (Cre依賴) | AAV9-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP |
| AV201017-AV9 (Cre依賴) | AAV9-EF1a-DIO-eArch3.0-EYFP |
| AV201021-AV9 (Cre依賴) | AAV9-EF1a-DIO-eNpHR3.0-EYFP |
| AV201003-AV2 (Cre依賴) | AAV2-CaMKIIa-DIO-hChR2(H134R)-mCherry |
| …… | |
| 化學遺傳學(操控神經元) | |
| AV202014-AV9 (Cre依賴) | AAV9-EF1a-DIO-hM4D(Gi)-mCherry |
| AV202010-AV9 (Cre依賴) | AAV9-hSyn-DIO-hM4D(Gi)-mCherry |
| AV202015-AV9 (Cre依賴) | AAV9-CaMKIIa-DIO-hM4D(Gi)-mCherry |
| …… | |
| 鈣指示劑(神經元成像) | |
| AV203006-AV8 (Cre依賴) | AAV8-EF1a-DIO-GCaMP6s-P2A-nls-dTomato |
| AV203006-AV9 (Cre依賴) | AAV9-EF1a-DIO-GCaMP6s-P2A-nls-dTomato |
| AV203009-AV8 (Cre依賴) | AAV8-EF1a-DIO-GCaMP6m-P2A-nls-dTomato |
| AV203009-AV9 (Cre依賴) | AAV9-EF1a-DIO-GCaMP6m-P2A-nls-dTomato |
| AV203009-AV2 retro (Cre依賴) | AAV2-retro-EF1a-DIO-GCaMP6m-P2A-nls-dTomato |
| AV203009-AV DJ (Cre依賴) | AAV-DJ-EF1a-DIO-GCaMP6m-P2A-nls-dTomato |
| AV203016-AV9 (Cre依賴) | AAV9-EF1a-DIO-GCaMP6f-P2A-nls-dTomato |
| AV203004-AV5 (Cre依賴) | AAV5-hSyn-DIO-GCaMP6s-P2A-nls-dTomato |
| AV203046 | AAV-EF1a-DIO-jGCaMP7b-P2A-nls-dTomato |
| AV203047 | AAV-EF1a-DIO-jGCaMP7c-P2A-nls-dTomato |
| AV203048 | AAV-EF1a-DIO-jGCaMP7s-P2A-nls-dTomato |
| AV203049-AV9 (Cre依賴) | AAV9-EF1a-DIO-jGCaMP7f-P2A-nls-dTomato |
| …… | |
1. Castle MJ, Gershenson ZT, Giles AR, Holzbaur ELF, Wolfe JH (2014a) Adeno-associated virus serotypes 1, 8, and 9 share conserved mechanisms for anterograde and retrograde axonal transport. Hum Gene Ther 25:705-720.
2. Zingg B, Chou X, Zhang Z, Mesik L, Liang F, Tao HW, Zhang LI (2017) AAV-mediated anterograde transsynaptic tagging: mapping corticocol-licular input-defined neural pathways for defense behaviors. Neuron 93:33-47.
3. Brian Zingg, Bo Peng, Junxiang Huang, Huizhong W. Tao, and Li I. Zhang(2020) Synaptic Specificity and Application of Anterograde Transsynaptic AAV for Probing Neural Circuitry. The Journal of Neuroscience 40 (16): 3250-3267.
