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腦是人體最神秘、最復雜的器官，由近1011個神經元組成，形成約1014-15個突觸，這種復雜的神經環路網絡為認知、情感、記憶、感覺和運動等大腦高級功能建立了穩固的結構基礎。如何認識神經元的連接方式，描繪神經環路的精細結構并認知其功能對于了解大腦的復雜功能至關重要。科學家們一直致力于找到可以特異性標記細胞種類、傳導方向可控、可視化的示蹤工具，以期實現對神經環路網絡的精確認識和研究。
利用神經示蹤工具實現對神經環路的精確標記，主要涉及兩大基本問題即方向性（順向、逆向）和是否跨突觸。順向(Anterograde)是由注射部位的神經元胞體經軸突下行至末梢，逆向(Retrograde)是由軸突末梢傳到細胞體；順向跨突觸是從胞體傳到軸突末梢后跨過突觸傳遞至下一級神經元，逆向跨突觸跟順向跨突觸相反，是由胞體逆向跨突觸傳遞至上一級神經元的軸突。如下圖所示：
（Strick P L，et al.，eLS，2011）
小V帶領大家一起了解神經環路示蹤工具的發展歷程，共同感受神經科學研究領域的飛速進步。
傳統神經示蹤工具
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種類 |
名稱 |
特點 |
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辣根過氧化物酶 |
辣根過氧化物酶(HRP) |
逆行示蹤劑，染色局限于細胞體和初生樹突 |
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蛋白 |
霍亂毒素B亞基(CTb) |
逆行示蹤劑，無毒 |
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熒光染料 |
熒光金(Fluoro Gold)
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逆行示蹤劑，顯示樹突分支，易觀察，不易擴散 |
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羰化青（Dil） |
逆行示蹤劑，顯示軸突，熒光強而穩定，無毒，不易擴散 |
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生物素 |
生物素化葡聚糖胺（BDA）
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順行示蹤劑，保存時間長，可與多種熒光示蹤劑及免疫組化技術相結合 |
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凝集素 |
麥芽凝集素（WGA）、菜豆凝集素(PHA) |
順行示蹤劑，注射后需要較長的存留時間才能實現轉運 |
上述這些傳統的示蹤劑被廣泛用于確定實驗動物不同腦區之間神經元的連接，促進了人們對大腦神經網絡結構的認識，但它們仍有以下缺點：①無法特異性標記細胞類型；②幾乎沒有跨突觸能力；③不能用于傳遞外源基因；難以用于多個腦區、多種類型神經元通過突觸連接形成的復雜神經網絡研究。
病毒示蹤劑的出現為上述問題的解決提供了新方案，并成為追蹤神經網絡連接的有效工具。
病毒示蹤工具
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病毒名稱和描述 |
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順向跨突觸病毒 |
HSV |
dsDNA，~152kb，包裝容量~130kb。毒力和傳播方向具有菌株依賴性。H129株優先順向跨突觸示蹤 |
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VSV |
-ssRNA，11-12kb，包裝容量<6kb。對人的毒性較低，極短時間高豐度表達目的蛋白，可被其他病毒的囊膜糖蛋白包裝而獲得不同方向的跨突觸能力 |
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逆向跨突觸病毒 |
RV |
-ssRNA，11.9kb，包裝容量<6kb。主要標記神經元，可導致致命的人畜共患疾病。改造的復制缺陷型RV毒性較低 |
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PRV |
dsDNA，~150kb，包裝容量~130kb。不能感染高等靈長類；野生型PRV毒性極高且雙向傳播。改造的PRV-Bartha株逆行跨突觸示蹤，毒性較低 |
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AAV血清型種類多，不同的血清型對神經元有不同的感染特性。神經科學研究中常用的AAV血清型有2、5、8、9、DJ、1/2、PHP、Anc80等，它們有高效轉導神經元的能力，可根據標記的神經元選擇合適的AAV血清型。此外，科學家也一直致力于AAV新血清型的開發研究，近日國際基因治療領域著名專家高光坪教授及其課題組鑒定出一種新AAV血清型AAVv66，其與AAV2具有高度序列相似性，但比AAV2產率更高、病毒穩定性更高及更好的中樞神經系統轉導能力，通過顱內和全身注射給藥時，AAVv66在腦組織內分布較AAV2更好。
常見的AAV病毒載體都是順向非跨突觸標記，AAV的逆向非跨突觸和順向跨突觸標記能力在科學家的潛心研究下取得了滿意成果，并被廣大研究者用于神經環路研究：
rAAV2-retro（逆向非跨突觸標記）
2016年D. GowanlockR. Tervo等通過定向進化的方法構建了一種新的AAV變體— rAAV2-retro，該變體具有逆行示蹤能力且效率與傳統的逆行示蹤劑相當，由此AAV的逆向非跨突觸標記能力被成功開發。下圖所示為rAAV2-retro的開發過程及應用實例：
AAV1（順向跨突觸示蹤）
2017年張礪教授團隊研究報道AAV1在高滴度條件下呈順向跨突觸傳播，與Cre依賴的報告系統相結合，可高效和特異性地驅動Cre依賴的外源基因在突觸后神經元中表達，標記突觸后神經元。2020年該研究團隊再次深入研究了AAV1順向跨突觸標記的作用機制——依賴于突觸囊泡的釋放，同時揭示了其在多種神經環路中的廣泛應用，為AAV作為順向跨突觸示蹤病毒工具對神經元及其投射腦區進行標記提供了諸多證據。我們相信AAV在神經環路中的應用將會越來越廣泛。（研究所用的AAV病毒部分由維真生物提供，欲知詳情請點擊往期回顧：）
AAV轉導神經元需要宿主細胞合成其基因的互補鏈，因此基因的高表達需要較多病毒顆粒和較長時間才能實現。雙鏈AAV(self-complementary AAV，scAAV) 進入細胞后，不需要由單鏈變為雙鏈的過程，基因表達更為快速，表達水平更高，不過scAAV的裝載量只有單鏈AAV的一半。例如2020年張礪教授團隊的科研論文就使用了scAAV，證實了scAAV1-hSyn-Cre具有更優越的順向跨突觸標記能力，可在興奮性、抑制性、神經調質和腦-脊髓等多種神經環路中有效、特異地標記單突觸靶神經元及其輸出，從而解析不同的功能/行為。
總 結
維真生物神經示蹤工具AAV產品及服務
如有需要，歡迎致電400-077-2566！
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產品編號 |
產品名稱 |
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AV204006-AVretro |
AAVretro-hSyn-Cre |
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AV204006-AV1 |
AAV1-hSyn-Cre |
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AV204046-AV1 |
scAAV1-hSyn-Cre |
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AV204006-AV2retro |
AAV2 retro-hSyn-Cre |
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AV204049-AV1 |
AAV1-hSyn-Flp |
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AV204050-AV1 |
AAV1-CAG-DIO-Flp |
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AV204054-AV1 |
AAV1-EF1a-DIO-Flp |
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…… |
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熒光蛋白（標記神經元） |
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AV200001-AV2retro |
AAV2 retro-CMV-GFP |
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AV200007-AV2retro |
AAV2 retro-hSyn-GFP |
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AV200109-AV1 (Cre依賴) |
AAV1-CAG-DIO-GFP |
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AV200160-AV2 (Cre依賴) |
AAV2-CAG-DIO-mCherry |
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AV200145-AV9 (Cre依賴) |
AAV9-EF1a-DIO-mCherry |
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AV200096-AV2 (Cre依賴) |
AAV2-hSyn-DIO-GFP |
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AV200096-AV9 (Cre依賴) |
AAV9-hSyn-DIO-GFP |
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AV200146-AV9 (Cre依賴) |
AAV9-hSyn-DIO-mCherry |
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AV200117-AV9 (Cre依賴) |
AAV9-CaMKIIa-DIO-GFP |
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AV200147-AV5 (Cre依賴) |
AAV5-CaMKIIa-DIO-mCherry |
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AV200147-AV9 (Cre依賴) |
AAV9-CaMKIIa-DIO-mCherry |
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…… |
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光遺傳學(操控神經元) |
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AV201006-AV2 (Cre依賴) |
AAV2-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-mCherry |
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AV201006-AV9 (Cre依賴) |
AAV9-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-mCherry |
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AV201007-AV2 (Cre依賴) |
AAV2-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP |
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AV201007-AV9 (Cre依賴) |
AAV9-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP |
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AV201017-AV9 (Cre依賴) |
AAV9-EF1a-DIO-eArch3.0-EYFP |
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AV201021-AV9 (Cre依賴) |
AAV9-EF1a-DIO-eNpHR3.0-EYFP |
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AV201003-AV2 (Cre依賴) |
AAV2-CaMKIIa-DIO-hChR2(H134R)-mCherry |
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…… |
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化學遺傳學(操控神經元) |
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AV202014-AV9 (Cre依賴) |
AAV9-EF1a-DIO-hM4D(Gi)-mCherry |
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AV202010-AV9 (Cre依賴) |
AAV9-hSyn-DIO-hM4D(Gi)-mCherry |
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AV202015-AV9 (Cre依賴) |
AAV9-CaMKIIa-DIO-hM4D(Gi)-mCherry |
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…… |
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鈣指示劑(神經元成像) |
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AV203009-AV2retro (Cre依賴) |
AAV2-retro-EF1a-DIO-GCaMP6m-P2A-nls-dTomato |
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AV203006-AV8 (Cre依賴) |
AAV8-EF1a-DIO-GCaMP6s-P2A-nls-dTomato |
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AV203006-AV9 (Cre依賴) |
AAV9-EF1a-DIO-GCaMP6s-P2A-nls-dTomato |
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AV203009-AV8 (Cre依賴) |
AAV8-EF1a-DIO-GCaMP6m-P2A-nls-dTomato |
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AV203009-AV9 (Cre依賴) |
AAV9-EF1a-DIO-GCaMP6m-P2A-nls-dTomato |
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AV203009-AV DJ (Cre依賴) |
AAV-DJ-EF1a-DIO-GCaMP6m-P2A-nls-dTomato |
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AV203016-AV9 (Cre依賴) |
AAV9-EF1a-DIO-GCaMP6f-P2A-nls-dTomato |
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AV203004-AV5 (Cre依賴) |
AAV5-hSyn-DIO-GCaMP6s-P2A-nls-dTomato |
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AV203046 |
AAV-EF1a-DIO-jGCaMP7b-P2A-nls-dTomato |
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AV203047 |
AAV-EF1a-DIO-jGCaMP7c-P2A-nls-dTomato |
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AV203048 |
AAV-EF1a-DIO-jGCaMP7s-P2A-nls-dTomato |
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AV203049-AV9 (Cre依賴) |
AAV9-EF1a-DIO-jGCaMP7f-P2A-nls-dTomato |
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…… |
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另有AAV9、AAV-PHP.B、AAV-PHP.eB等可跨血腦屏障的血清型AAV產品。關注我們了解更多產品詳情~
Reference
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2. Sun L, Tang Y, Yan K, et al. Differences in neurotropism and neurotoxicity among retrograde viral tracers. Mol Neurodegener. 2019;14(1):8. Published 2019 Feb 8. doi:10.1186/s13024-019-0308-6.
3. Li J, Liu T, Dong Y, Kondoh K, Lu Z. Trans-synaptic Neural Circuit-Tracing with Neurotropic Viruses. Neurosci Bull. 2019;35(5):909-920. doi:10.1007/s12264-019-00374-9.
4. Zingg, B., et al., AAV-Mediated Anterograde Transsynaptic Tagging: Mapping Corticocollicular Input-Defined Neural Pathways for Defense Behaviors. Neuron, 2017. 93(1): p. 33-47.
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6.Tervo et al.,A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons .Neuron .2016, 92, 372–382.
7.Hsu, H., Brown, A., Loveland, A.B. et al. Structural characterization of a novel human adeno-associated virus capsid with neurotropic properties. Nat Commun 11, 3279 (2020).
