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1. AAV 和重組rAAV的區別？

 腺相關病毒（AAV）屬于微小病毒科，是一類小的、二十面體、無包膜病毒。1965年，AAV發現于腺病毒制備物中，并由此得名。AAV是一種復制缺陷性病毒，其復制依賴于其他輔助病毒，如腺病毒和皰疹病毒。AAV不編碼自己的聚合酶，因此其復制過程依賴于宿主細胞的聚合酶活性。

 重組AAV（rAAV）是人工改造的AAV，沒有編碼AAV病毒復制和結構蛋白的rep和cap基因。rAAV中與復制和包裝相關的rep和cap 基因被替換為ITRs間的基因表達框，這使rAAV具有約4.7 kb的包裝容量。

2. 使用AAV有哪些生物安全性要求 ?

 可在生物安全1級（BSL-1）實驗室操作生產無輔助病毒和編碼非致癌基因的重組AAV。另外，應在生物安全2級（BSL-2）實驗室封閉處理具有生物危害性的材料。

3. 重組AAV 安全嗎 ?

 迄今為止，未發現野生型AAV有致病性。野生型AAV，在無需輔助病毒（如腺病毒）的存在下，復制效率非常低。重組腺相關病毒（rAAV）由多個質粒（cis質粒、輔助質粒、rep/Cap質粒）組成。Cis質粒、輔助質粒與rep/Cap質粒之間不具有同源性序列，因此重組AAV在理論上不具有復制的能力。

4. 重組AAVs的克隆容量有多大?

 AAV具有?4.7Kb的包裝能力。2個ITR之間插入的DNA長度接近允許的最大值4.7Kb時，包裝效率顯著降低。例如，對于過表達來自cDNA的基因，CMV-poly（A）信號元件約為1KB，因此最大可包裝的cDNA長度約為3.2kb，如果共表達GFP（約0.8kb），則可包裝的容量大約為2.4kb。

5. 哪些血清型的AAV可供選擇？

 目前為您提供的AAV 血清型為AAV1，AAV2，AAV5，AAV6，AAV7，AAV8 &，AAV9，AAV rh10，AAV retro，AAV ANC80，AAV DJ & AAV DJ-8，AAV PhpB & AAV PhpeB，AAV 7m8和AAV shh10等。

6. 使用重組腺相關病毒rAAV遞送基因的優勢是什么 ?

rAAV病毒滴度高，可感染分裂和非分裂細胞、免疫原性小、體內表達外源基因時間長。

7. AAV載體穩定嗎? 如何保存AAV載體 ?

純化的AAV載體在4℃或更低溫度下高度穩定。建議您將AAV分裝后，-80℃下長期保存。

8. 訂制AAV服務，客戶需要提供哪些材料? 客戶收到的產品是怎樣的 ?

 您可以從我們的人源ORF cDNA庫中挑選，或者提供您的質粒DNA或DNA序列，我們將基因克隆至AAV載體。您還可以指定特定的融合標簽和AAV血清型。

 基因沉默服務，請您提供已驗證的shRNA序列以構建重組rAAV載體。我們的標準載體具有U6啟動子和GFP標記。

 通常情況下，可為客戶提供500 ul病毒液1×10^13 VP/ml。也可根據客戶的需要，提供特定規格的產品。

9. 慢病毒、腺病毒、腺相關病毒三種病毒有什么區別？如何選擇？

對于轉染困難的細胞，科研工作者通常會選擇病毒來導入目的基因。目前，腺病毒、慢病毒和腺相關病毒是常用的病毒載體工具。那么如何選擇適合您實驗體系的病毒工具，請參考下面3種病毒工具的比較：

1. 您好，我感染的細胞是滋養層細胞，感染之前在六孔板中接種十萬細胞，貼壁16h后加加入病毒（MOI=40），30h后細胞長滿。我想咨詢：病毒感染后實驗組跟對照組相比細胞生產差不多，正常嗎？

 如果感染腺病毒的細胞狀態與未感染組的細胞狀態無明顯差異，說明該病毒對細胞沒有明顯毒性作用。因此，未必是病毒數量不夠。非腺病毒包裝細胞被腺病毒感染后是不會有什么明顯的特征。如果您在加入病毒的時候是提前把病毒用培養基稀釋混勻之后再加入培養皿中的，那么高MOI值（導致細胞飄起來）對于目的細胞是比較高的。因此，您不用擔心，可以先檢測一下是否有蛋白表達。

2. 腺病毒感染細胞后是否需要更換新鮮培養液？

 是否需要更換新鮮培養液需要看加入病毒的量，病毒量多的時候會對細胞有毒性：如果鏡檢時看到細胞狀態有變化，需要在4-8h左右更換新鮮培養液；如果鏡檢時看到細胞狀態無明顯變化，那么病毒感染細胞之后就無需更換新鮮培養液。或者，如果您擔心病毒長時間作用于細胞會有毒性，也可在12h后更換新鮮培養液。

3. 腺病毒感染細胞4-6h之后發現細胞全部飄起來了，請問這是怎么回事？

造成上述現象的原因主要有三點：

1）細胞的狀態：感染之前鋪板的細胞一定要使用健康的細胞；

 2）實驗操作不當：在加入病毒液的時候，如果局部病毒濃度過高會導致細胞死亡。因此，我們建議將病毒和培養基混勻之后再加入細胞中。

3）如果以上2點均無誤，那就是加入的病毒量太大了。

4. 腺病毒感染細胞時，加入病毒量的依據是什么？

要得到最佳實驗結果，確定腺病毒的最適用量是關鍵。量不足達不到100%感染效率；量太高則會對細胞產生毒性。那么如何確定呢？"感染復數"(MOI，multiplicity of infection)起著決定作用。MOI是是感染時病毒與細胞數量的比值。不同細胞系細胞表面的腺病毒受體數量不同，這就決定了不同細胞系的MOI會有所不同。通常，易感染細胞系所使用的MOI范圍為10-100。 但是，對于某些難感染的細胞系，MOI可能需要高達1000。對于大多數細胞系來說，最佳MOI的范圍很窄。我們建議您查閱文獻或者在正式實驗前，在目的細胞中用報告基因的腺病毒進行預實驗摸最佳MOI。

最適病毒用量的計算公式：
病毒用量pfu=最佳MOI×細胞數目/病毒滴度
例如, 如果您目的細胞的最佳MOI=10，您需要感染106的細胞，那么您共計需要107pfu的病毒. 如果病毒滴度為1×10¹⁰ pfu/mL, 那么您實驗需要的病毒量就是1ul.

5. 腺病毒感染細胞之后多久可以從基因水平和蛋白水平檢測表達？如果蛋白是分泌性蛋白和非分泌性蛋白，檢測時間是否有區別？

 腺病毒攜帶的目的基因表達快。如果您想從基因水平檢測基因的表達，那么在病毒感染細胞12-24h之間進行檢測；如果您想從蛋白水平檢測基因的表達，那么在病毒感染細胞48-72h之間進行檢測。

 對于分泌性蛋白和非分泌性蛋白，檢測時間一樣。如果擔心蛋白分泌出來，也可以將培養基也一起帶著做western blot。

6. 腺病毒毒種被細菌污染了，沒有多余毒種，也沒有構建好的載體，怎么辦？

 因為腺病毒的直徑大小是90-100nm，而細菌的直徑大小要大的多，可以用22um的濾器進行過慮。如果您的病毒量很低，擔心過慮后損失太多，無法進行后面的擴增工作，您可以先用污染了細菌的腺病毒直接擴增，當然擴增的結果是得到了污染了細菌的腺病毒，但病毒的量會提高一些，這樣再用22um的濾器進行過濾。

7. 如何鑒定腺病毒遞送的目的基因？

可以按照如下方法進行鑒定：

①針對基因設計引物，同時作為擴增和測序引物；

②將病毒用蛋白酶K處理后做為模板，如果是未純化的病毒還需要過純化柱處理掉培養基的成分；

③以處理過的病毒為模板進行PCR；

④用PCR引物對PCR產物測序。

8. 慢病毒、腺病毒、腺相關病毒三種病毒有什么區別？如何選擇？

對于轉染困難的細胞，科研工作者通常會選擇病毒來導入目的基因。目前，腺病毒、慢病毒和腺相關病毒是常用的病毒載體工具。那么如何選擇適合您實驗體系的病毒工具，請參考下面3種病毒工具的比較：

1、什么情況下選用慢病毒？

 慢病毒的宿主范圍比較廣，既能感染分裂細胞，也能感染非分裂的細胞，在體內外研究中均可選擇慢病毒作為病毒載體。此外，慢病毒也是構建穩轉株的理想病毒。

2、慢病毒載體可插入多大的 ORF 片段？

 一般情況下，慢病毒載體可容納8 kb插入片段。然而，插入的ORF基因大于4 kb時會大大降低病毒的包裝效率，進而影響病毒滴度甚至基因表達。

3、用于慢病毒感染的細胞接種量是多少？

將狀態良好的目的細胞接種到24孔板，細胞濃度一般為1×10⁵/mL細胞，接種細胞數量需要考慮到細胞活力因素、狀態因素、生長快慢因素、分裂因素等，一般是保證病毒感染時細胞匯合率達到50%-70%為佳。

4、什么是 MOI ？

 MOI （multiplicity of infection），即感染復數，指的是感染時病毒與細胞數量的比值。一般認為MOI是一個比值，沒有單位。

5、慢病毒是否能夠穩定表達基因？

 是的。慢病毒能將外源基因整合到宿主基因組中，不會隨著細胞分裂傳代而丟失，因此能實現外源基因的長期穩定表達。

6、維真慢病毒的包裝周期是多久？

 如果客戶提供構建好的慢病毒載體，那么包裝時間一般為2周左右，若包含前期載體構建等的時間，時間大概在5周左右。

7、慢病毒感染細胞后，目的基因的表達什么時間達到峰值？

 慢病毒感染目的細胞后，一般情況下，在72-96h目的基因的表達能達到峰值，但是對于一些特殊細胞、如增殖傳代比較慢的細胞，蛋白表達達到峰值則需要更長的時間。

8、怎樣提高慢病毒的感染效率？

 細胞良好的生長狀態和感染時適合的 MOI 值是達到高感染效率的保證。一般可以通過提高感染時的 MOI 值來提高病毒的感染效率，必要時可在感染時加入助感染試劑ADV-HR來提高慢病毒的感染效率。

9、慢病毒感染后，細胞狀態很差，甚至出現死亡，為什么？

 慢病毒會對細胞造成一定的毒性，不同細胞對毒性的耐受力不同。建議調整并降低感染時使用的MOI值，即可在細胞準備時增加鋪板細胞的匯合率（可提高至 70%），調整感染時加入的病毒量。此外，還可選擇在感染4小時后換液，用新鮮的完全培養液繼續培養觀察。

10、慢病毒、腺病毒、腺相關病毒三種病毒有什么區別？如何選擇？

對于轉染困難的細胞，科研工作者通常會選擇病毒來導入目的基因。目前，腺病毒、慢病毒和腺相關病毒是常用的病毒載體工具。那么如何選擇適合您實驗體系的病毒工具，請參考下面3種病毒工具的比較：