腺病毒-PB轉座系統
眾所周知，慢病毒載體作為基因傳遞的工具很大一個優勢就是具有整合特性，非常適合構建穩轉細胞株，但包裝容量小、病毒滴度低也是限制它大顯身手的弊端所在，因此只適合常規基因，而無法實現較大基因的穩轉株構建。而AAV雖然是體內研究的理想載體，但由于載體容量等原因也無法實現較大基因在體內的長期穩定表達。因此，開發一種新的基因傳遞工具對于較大基因的體內外研究至關重要。
腺病毒包裝容量大，幾乎能感染所有類型的細胞，容易制得高滴度的病毒，而且非常適合體內外研究，因此利用腺病毒來制備穩轉株并實現基因在體內的長期穩定表達，可能是開發這一新型工具的重要突破口。然而，腺病毒感染細胞只能實現基因的瞬時表達，單從這一點考慮，恐難實現。如何才能發揮其長處，彌補其短板，是需要攻克的難點。
Gene delivery
這不，最近小編聽說，腺病毒已經“拓展業務”跑來做穩轉株了，這是怎么回事兒？原來，腺病毒深化了對外交往，與PiggyBac（PB）轉座子開展了合作。我們知道，PB轉座子是研究基因功能,制備轉基因動物及基因治療的優良載體，具有廣泛宿主譜，通過“剪切-粘貼”機制介導外源基因的穩定整合與表達。但其目前應用的主要方式仍是通過質粒轉染，而質粒載體本身存在轉導效率低、非整合等弊端。因此，本次腺病毒與PB的合作將是值得萬眾期待的。
腺病毒與PiggyBac（PB）強強聯合
一、轉座子系統介紹
轉座子又稱跳躍因子，是基因組中一段可移動的DNA序列，它們可以直接從基因組的一個位點“跳躍”到另一個位點，轉座子發生位置轉移的過程即為轉座。轉座子載體系統轉座時可攜帶一段外源DNA序列，從而實現目的基因的轉移。根據轉座機制的不同，可將轉座子分為兩大類：逆轉錄轉座子和DNA轉座子。逆轉錄轉座子以RNA為媒介進行轉座，采用“復制-粘貼”機制，即先將自身DNA轉錄形成RNA中間產物, 再逆轉錄產生新的DNA拷貝,最后插入基因組的其他位置實現轉座, 而原位點的轉座子保持不變。DNA轉座子則以DNA為媒介進行轉座，采用“剪切-粘貼”轉座機制，在轉座酶的作用下, 轉座子從原位置切除下來并整合到新的位點。DNA轉座子相對逆轉錄轉座子而言，轉座效率高，易被人為改造，因而應用較為廣泛，其具體轉座機制如圖1。
圖1. DNA轉座子轉座機制示意圖
野生型的DNA轉座子中通常含有轉座酶編碼序列，轉座酶通過識別轉座子兩端的ITR（反向末端重復序列），介導轉座子發生轉移。經人工改造后，中間的轉座酶編碼序列可被其它外源DNA序列所替換，在細胞中轉座酶存在的情況下發生轉座，從而將外源DNA插入基因組中，實現轉基因操作。
圖2. DNA轉座子實現轉基因操作的機制示意圖
A:野生型DNA轉座子 B:人工修飾的轉座子載體 C:轉座酶表達載體
目前，已在真核生物中發現數10種DNA轉座子，具體分類和特征如下：
圖3. 真核生物DNA轉座子分類
轉座子可以在基因組任意位置插入和切除，常用于哺乳動物細胞基因編輯研究中。目前發現的可用于哺乳動物基因轉移的DNA轉座子系統主要有3類：類hAT轉座子Tol 2，兩個類Tc1轉座子Sleeping Beauty ( SB) 和 Frog Prince ( FP)，Piggy Bac超家族成員Piggy Bac（PB）。其中，PB轉座系統憑借其轉座效率高，宿主范圍廣等優勢，近年來已在哺乳動物細胞中得到了廣泛的應用，也是本文的介紹重點。
二、PB轉座系統
1、結構特點
PB轉座子屬于DNA型轉座子，全長2476 bp。PB轉座子末端為長13 bp的反向重復序列（ITRs），在其內部不對稱分布有19 bp的亞末端反向重復序列（sub-ITRs），sub-ITRs中間有一個1.8 kb的開放閱讀框，編碼594個氨基酸的piggyBac轉座酶，分子量為64 kDa，該轉座酶是轉座子轉座過程所必需的。
圖4. PB轉座子的結構示意圖
2、轉座模式
PB轉座子的轉座遵循“剪切-粘貼”機制，在哺乳動物細胞基因組DNA中靶向TTAA序列。當piggyBac轉座酶蛋白在哺乳動物細胞中表達時，它會與轉座子的反向重復序列結合，切割DNA并釋放轉座子兩端的3’-OH，3’-OH攻擊互補鏈5’端的TTAA序列并形成發夾結構，從而將轉座子從質粒主鏈中釋放出來，斷裂的質粒主鏈會在DNA連接酶的作用下重新連接起來而不留下任何痕跡。與此同時，目標染色體的特定位點（TTAA位點）被剪切為粘性末端雙鏈斷口，切下的PB轉座子在PB酶的作用下連入被切開的目標染色體中并把粘性末端補平，從而導致被插入目標染色體的轉座子兩側都存在TTAA。
在大多數應用中，piggyBac轉座酶和piggyBac轉座子分別由兩個單獨的質粒攜帶，通過瞬時轉染的方式導入細胞，因而會逐漸丟失，轉座酶的丟失使轉座子在宿主基因組中實現永久整合。當細胞中再次表達PB轉座酶時，會把轉座子從宿主基因組上切除，使宿主基因組恢復原狀，序列不會發生任何改變，這稱為“無縫切除”。
圖5. PB轉座子的作用機制
3、優勢
①轉座效率高。 PB轉座系統靶向于基因組的TTAA位點，而在基因組中TTAA序列出現較為頻繁，平均每246 bp便會出現一個TTAA位點。
②裝載容量大。PB轉座系統攜帶的外源片段可長達幾十Kb。
③可介導外源基因的穩定整合和表達。
④插入位置易檢測。可利用反式PCR方法迅速而精確地進行突變位點的檢測。
⑤可以實現“無縫切除”。轉座酶的再次表達可將導入的外源基因切除, 而不影響內源基因的表達。
三、腺病毒與轉座子聯手，助力體內外研究
在實際應用過程中，轉座酶和轉座子分別被構建在兩個載體上，而后導入細胞。無論是質粒組還是腺病毒組，添加轉座酶組細胞存活數量要遠遠多于未添加組，說明轉座酶在轉座過程中的必需性；而腺病毒組細胞存活數量整體多于質粒組，說明腺病毒轉座體系的效率更強。（圖A、B為質粒轉座體系，圖C、D為腺病毒轉座體系）
質粒轉座子體系 pk 腺病毒轉座子體系
1、腺病毒轉座體系較質粒轉座體系效率更高
首先，我們將PB轉座子和轉座酶分別構建至腺病毒載體并包裝腺病毒，分別通過質粒和病毒感染兩種方式處理A549細胞。發現，質粒轉染48小時，Puro加壓7天后，加轉座酶組細胞大量存活，而對照組細胞幾乎全部凋亡。腺病毒感染48小時，Puro加壓兩周后，加轉座酶組細胞穩轉擴增，對照組細胞逐漸凋亡（如下圖所示）。這說明，轉座酶在轉座子轉座過程是必需的，且腺病毒轉座子比質粒轉座子轉座效率更高。
質粒組與病毒組實驗結果
2、腺病毒-PB轉座體系效率分析
為評估腺病毒-PB轉座體系的轉座效率，我們對腺病毒組存活細胞數量進行了分析。計數與染色結果顯示，加轉座酶組的存活細胞數量是未加轉座酶組的近33倍（如下圖所示）。
腺病毒組存活細胞數分析
結語
腺病毒與PiggyBac轉座系統的融合，既可進行細胞的高效感染，又可實現外源基因在宿主細胞的穩定整合與表達。因此，如果您有基因的穩轉需求，無論是常規基因還是較大基因，常規細胞還是難感染的細胞，體內研究還是體外研究，都可以優先選擇腺病毒-PB轉座體系。利用這一體系可以完美地解決穩轉株構建以及外源基因在動植物體、組織中穩定表達的難題，尤其是對那些較大基因來說，這一體系尤其適用，歡迎各位老師咨詢訂購！
維真生物腺病毒-PB轉座系統部分載體
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載體名稱
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啟動子
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抗生素
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熒光蛋白
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pADM-PB-CMV-EGFP-mCMV-Puro
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CMV
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Puro
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GFP
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pADM-PBase
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CMV
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參考文獻
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