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 2016年，科學家發現了可以靶向RNA進行切割的CRISPR/Cas13系統，該系統由單一的效應蛋白Cas13和CRISPR RNA（crRNA）組裝形成一個由crRNA引導的RNA靶向效應復合物。目前，Cas13家族共鑒定出四種亞型，包括Cas13a（又名C2c2）、Cas13b、Cas13c和Cas13d，四種Cas13亞型蛋白分子量均小于Cas9蛋白。

所有Cas13蛋白均具有兩種不同的催化活性：

 ①由兩個較高等的真核和原核核苷酸結合（Higher eukaryotes and prokaryotes nuceotide-binding，HEPN）結構域提供的RNase活性，這是靶RNA降解所必需的。Cas13 四個亞型同源性較低，且同源序列僅限于HEPN結構域位點，此外兩個HEPN結構域中的單點突變會使CRISPR/Cas13系統對RNA的切割能力完全喪失；

②催化pre-crRNA加工和形成成熟crRNA的RNase活性。

圖1.CRISPR/Cas13系統介紹

 與CRISPR II類系統的其它核酸酶結構一致，Cas13a的整體結構是雙葉的，N-末端結構域（N-terminal domain，NTD）和Helical-1結構域構成crRNA識別葉（REC lobe），HEPN1、Helical-2、HEPN2結構域形成核酸酶葉（NUC lobe）（圖2）。CRISPR/Cas13b系統有兩種酶，分別是VI-B1和VI-B2，它們之間的區別在于Cas13b轉座子上攜帶的附屬蛋白的基因型不同，VI-B1的附屬蛋白是Csx28，而VI-B2的附屬蛋白是Csx27。絕大多數Cas13d型系統還含有包含 WYL結構域的相關輔助蛋白，WYL結構域通常與原核防御系統有關（圖1）。

圖2.Cas13a蛋白結構域示意圖

 所有的Cas13蛋白酶都需要60- 66 nt的crRNA來確保靶向特異性。四種亞型crRNA都有一個促進與相應Cas13蛋白酶結合的直接重復（Direct repeat，DR）以及特異性靶向轉錄本的間隔序列。Cas13b的crRNA在3’端攜帶直接重復，而Cas13a、c和d的crRNA在5’端攜帶直接重復（圖3）。

圖3.Cas13a蛋白結構域示意圖

主要包括以下幾個階段（以Cas13a為例）：

 ①pre-crRNA 的識別與結合。新轉錄的pre-crRNA通過crRNA的5’端莖環結構與Cas13a的REC葉識別并結合，形成pre-crRNA與Cas13a復合物的中間過渡態；

 ②成熟crRNA的形成。NUC區的Helical-1和HEPN2結構域之間保守殘基的構象發生變化，從而形成一個酸堿催化中心，催化酶切pre-crRNA形成成熟的crRNA。此時的crRNA-Cas13a復合物處于無酶切活性狀態；

 ③crRNA-Cas13復合物酶切活性的激活。靶ssRNA進入crRNA-Cas13a復合物內與crRNA發生堿基互補配對，誘發Cas13a發生構象變化，從而激活crRNA-Cas13a復合物的酶切活性；

 ④靶RNA的降解。在crRNA的引導下，Cas13a的HEPN結構域催化靶ssRNA的酶切。有時細菌細胞中會出現非特異性酶切的情況，導致細胞中其他附屬ssRNA的降解，引起一定的細胞毒性，但這種現象在哺乳動物細胞中并未出現，其原因目前尚未可知。（圖4）。

圖4.CRISPR/Cas13系統作用機制示意圖

 2018年，加州大學伯克利分校Patrick D. Hsu實驗室發現了靶向RNA的Cas13d家族，Cas13d平均大小為930 aa，是目前發現的哺乳動物細胞中相對較小的Ⅱ類CRISPR效應因子（比其家族成員Cas13a-c小20%，比Cas9小33%），使它更容易包裝到容量有限的應用載體如AAV載體中。此外，Cas13d對RNA靶點的切割不依賴于PFS序列（protospacer flanking sequence，相當于Cas9針對DNA的PAM序列），這極大的增加了Cas13d的應用范圍，使其成為進一步開發靶向RNA工具的潛在平臺。與RNA干擾技術相比，Cas13d介導的基因沉默具有更高的特異性（與數百個shRNA脫靶相比，Cas13d沒有脫靶）和敲除效率（Cas13d達到96％，shRNA達到65％， CRISPRi達到53％）。而與Cas9介導的基因敲除技術相比，Cas13d介導的基因沉默不會改變基因組DNA，因此這種基因沉默是可逆的，對一些后天性疾病的治療更有優勢（圖5，6）。

圖5.一種引導和靶向激活Cas13d核糖核酸酶活性的模型

圖6.Cas13d系統具有更高的特異性和敲除效率

 2020年的一項研究探索了使用CasRx系統來定向沉默基因的可行性。首先，研究者選擇Pten作為代謝調控基因，研究CasRx是否能以代謝基因為靶點進行有效的基因敲除，并制備了多個針對Pten mRNA編碼序列的sgRNAs，研究者將CasRx和每個Pten sgRNA通過質粒轉導至小鼠神經母細胞瘤N2a細胞中，并進行sgRNA的體外篩選，找到了CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA組合：sgPten-5和sgPten-6。結果顯示，在轉染CasRx、sgPten-5和sgPten-6的N2a細胞中，Pten的表達水平顯著降低，AKT的磷酸化水平顯著升高，此外與shRNA系統相比，CasRx編輯系統表現出來更強的特異性和更低的脫靶率（圖7）。（延伸理解：Pten被認為是一種代謝調節劑，通過抑制PI3K/AKT途徑抑制胰島素信號轉導通路，Pten的缺失能促進AKT的磷酸化）

圖7. CasRx體外介導Pten的敲除

 研究人員通過尾靜脈注射敲低Pcsk9的AAV8病毒，顯著降低了肝臟和血清中Pcsk9的表達量以及血清中的膽固醇水平。重要的是，CasRx介導的Pcsk9敲低是可逆的，Pcsk9表達水平可以反復下調。CRISPR/CasRx系統為可逆調節代謝基因，尤其是一些后天性疾病（如因不良生活習慣導致的高血脂等后天代謝性疾病等）提供了一種有效的策略（圖8）。

圖8. CasRx介導的血清膽固醇降低和PCSK9可逆調節