分子克隆服務
為研究某一基因的生物學功能，通常需要先將所研究的基因克隆出來，這就需要用到分子克隆技術。目前，分子克隆已經成為分子生物學研究中的基礎方法。維真生物憑借豐富的分子克隆經驗以及專業的技術團隊，為您提供高效快捷的分子克隆服務，幫您從繁瑣的分子克隆實驗中解脫出來，從而使您能夠集中精力投入到創新性研究工作中。維真生物的分子克隆服務可以靈活地滿足研究者不同科研項目的要求，主要包括如下幾個方面：
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服務編號 |
服務類型 |
規格 |
目錄價 |
貨期 |
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WZ010001 |
載體構建 |
5ug質粒+500ul菌液 |
基因長度≤3kb， 模板費用+￥1,200.00； 基因長度＞3kb，≤4kb，模板費用+￥2,400.00； 基因長度＞4kb，詢價 |
2-4周 |
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WZ010002 |
載體改造 |
5ug質粒+500ul菌液 |
2-4周 |
*如您對上述服務感興趣，請您點擊“歡迎垂詢”留下您的信息，我們將為您提供具體實驗方案和項目價格。
相關服務：定點突變 腺病毒包裝 慢病毒包裝 腺相關病毒包裝服務 穩定細胞系建立
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↓↓ 分以下幾個部分做詳細介紹 ↓↓ |
分子克隆(molecular cloning)又稱為基因克隆、基因工程、DNA克隆、重組DNA技術。DNA重組技術是20世紀70年代初興起的技術，目的是將不同的DNA片段按照人們的設計定向連接起來，在特定的受體細胞中與載體同時復制并得到表達，產生影響受體細胞的新的遺傳性狀。而載體是一種運輸工具，它將一個有用的目的DNA片段通過DNA重組技術，遞送至受體細胞進行繁殖或表達。在基礎研究中，常用的載體是質粒和病毒。
質粒(plasmid)是一種獨立于染色體外的穩定的遺傳因子，為雙鏈、閉環的DNA分子，并以超螺旋狀態存在于宿主細胞中，大小從1-200kb不等。它主要存在于細菌、放線菌和真菌細胞中，具有自主復制和轉錄能力，但是需要依賴宿主細胞編碼的酶和蛋白。它能在子代細胞中保持恒定的拷貝數，并表達所攜帶的遺傳信息。
質粒按照功能可以分為克隆質粒和表達質粒。作為理想的克隆質粒，質粒需要具備以下條件：①一個復制起點ori(replication origin)，這是質粒自我復制必不可少的基本條件；②一個或者多個選擇性標記基因，如抗生素抗性基因；③多克隆位點：外源基因插入后不影響質粒的復制；④分子量小，易于操作，插入外源基因后仍可有效遞送至受體細胞；⑤拷貝數多，方便外源基因在細胞內大量擴增；⑥具有較好的安全性，不能任意轉移。下圖是克隆質粒的圖譜：
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相對于克隆質粒，一個表達質粒所包含的元件要更復雜。下面是表達質粒的圖譜和常見元件：
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元件 |
描述 |
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復制起始(ori) |
有利于質粒自我繁殖。 |
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抗生素抗性基因 |
為了方便篩選在細菌中擴增得到的質粒DNA，質粒中需要添加便于篩選的抗生素抗性基因。常使用的抗性基因包括：Ampicillin、Kanamycin、Hygromycin B、Spectinomycin、Tetracycline等等。 |
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多克隆位點（MCS） |
MCS是包含幾個限制性酶切位點的DNA短片段，可以通過限制性酶進行酶切連接插入外源DNA。在表達質粒中，MCS通常位于啟動子的下游，且限制性酶切位點是唯一的，不存在于質粒其他位置。 |
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插入片段 |
插入片段是克隆到MCS中的基因，啟動子或其他DNA片段。 插入片段通常是進行特定研究的遺傳元件。 |
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啟動子 |
驅動插入DNA片段進行轉錄。啟動子招募特定生物的相關轉錄機制。特定生物可以選擇特定的啟動子；另外，啟動子還可以指導細胞特異性表達，通過組織特異性啟動子來實現。啟動子的強度對于插入DNA片段的表達水平也很重要（即強啟動子能夠使插入DNA片段高表達，而弱啟動子則可以使插入DNA片段呈現內源性表達水平）。 |
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選擇性標記 |
選擇標記通常以非細菌啟動子控制的抗生素抗性基因或熒光蛋白的形式存在。作為選擇性標記，在遺傳選擇和篩選檢測方面都能夠便于實驗中的測定。 |
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引物結合位點 |
此序列有利于檢測插入基因的正確性和質粒上其他區域序列的正確性。 |
對于轉染困難的細胞，科研工作者通常會選擇病毒來導入目的基因。目前，腺病毒、慢病毒和腺相關病毒是常用的病毒載體工具。那么如何選擇適合您實驗體系的病毒工具，請參考下面3種病毒工具的比較：
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病毒表達系統 |
腺病毒 |
腺相關病毒 |
慢病毒 |
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病毒基因組 |
dsDNA |
ssDNA |
ssRNA |
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病毒外殼 |
無 |
無 |
具有包膜蛋白 |
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基因組大小 |
38-39kb |
5kb |
9kb |
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包裝容量 |
7.5kb |
4.7kb |
6kb |
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感染的細胞類型 |
分裂細胞和非分裂細胞 |
分裂細胞和非分裂細胞 |
分裂細胞和非分裂細胞 |
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整合至宿主基因組 |
非整合 |
非整合 |
整合 |
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表達豐度 |
高水平表達 |
高水平表達 |
中到高水平表達 |
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表達時間 |
快（1-2天） |
1-2周（體內） |
慢（2-4天） |
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外源基因持續表達時間 |
短暫 |
潛在的持久 |
長久 |
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免疫反應 |
較高 |
極低 |
低 |
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相對病毒滴度 |
10E10pfu/mL |
10E13VG/mL |
10E8TU/mL |
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生物安全等級 |
BSL-2 |
BSL-2 |
BSL-2 |
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質粒憑借操作簡單、易于制備、性能穩定和用途廣泛等特點已成為分子生物學的基本工具。因此，分子克隆技術已成為每個科研工作者必備的一項技能。它雖然簡單，卻很花時間。維真生物是您不二的選擇，主要有以下幾點特色：
| 1. | 維真生物擁有2大人源基因質粒庫，包括人源ORF cDNA克隆和人源microRNA克隆。基因模板可以直接用現成的，省去了獲得模板的煩惱； |
| 2. | 維真生物的技術團隊擁有豐富的克隆經驗，只要您提出實驗需求，我們就可出具相應的實驗方案，將您的實驗需求落地； |
| 3. | 無論您的目的是哪一種(蛋白編碼基因、lncRNAs、microRNAs、circRNA和啟動子等調控序列)，維真生物均不在話下； |
| 4. | 維真生物提供質粒構建、病毒包裝和基因表達分析等服務，滿足您不同實驗需求； |
5.維真生物的四環素誘導系列載體和Cre on & Flp on系列載體滿足您時空條件性控制目的基因表達的實驗需求。
我們常說的分子克隆通常包括合成模板、酶切、連接、轉化、挑菌和重組克隆驗證步驟。下面以從AAV ORF質粒構建到病毒包裝為例說明，服務流程示意圖如下：
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Step 1：選擇合適的載體
選擇載體的時候，通常要考慮諸多因素，比如細胞類型，基因大小，基因是否具有特殊性等。維真為您提供各種基因表達載體以及病毒載體，此外，您也可以自己提供載體。對于某些難感染的細胞，病毒載體的效率要遠遠優于質粒載體，而每種病毒穿梭系統都有其各自的特點。
Step 2：選擇合適的啟動子
載體的包裝容量問題，是選擇載體時的關鍵考慮因素。由于載體包裝容量有限，因此要選擇效果好且大小合適的啟動子，下表列舉一些維真現有的組織特異性啟動子，如果您沒找到想用的啟動子，可以聯系我們。
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組織 |
啟動子名稱 |
啟動子 |
啟動子 |
啟動子描述 |
啟動子應用 |
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神經 |
hSyn |
471bp |
人源 |
突觸蛋白1啟動子 |
神經元特異性啟動子 |
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CamKIIa |
1.2kb |
小鼠 |
鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II α啟動子 |
大腦新皮質和海馬興奮性神經元特異性啟動子 |
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c-fos |
1.7kb |
小鼠 |
c-fos基因啟動子 |
興奮性神經元啟動子 |
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Mecp2 |
230bp |
小鼠 |
甲基 CpG 結合蛋白 2啟動子 |
短的神經元特異性啟動子 |
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NSE |
1.3kb |
小鼠 |
烯醇化酶啟動子 |
神經元特異性啟動子 |
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Somatostat(SST) |
1.2kb |
人源 |
生長抑制素I基因的啟動子 |
gamma氨基丁酸能抑制性神經元SST亞型特異性啟動子 |
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TH |
2.5kb |
大鼠 |
酪氨酸羥化酶基因啟動子 |
多巴胺能神經元特異性啟動子 |
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GFAP |
2.0kb |
人源 |
膠質纖維酸性蛋白啟動子 |
星形膠質細胞特異性啟動子 |
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GFAP104 |
845bp |
人源 |
EF1a和GFAP的嵌合型啟動子 |
星形膠質細胞特異性啟動子 |
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GfaABC1D(truncated GFAP) |
681bp |
人源 |
膠質纖維酸性蛋白啟動子 |
星形膠質細胞特異性啟動子 |
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ALDH1L1 |
1.3kb |
人源 |
醛脫氫酶1家族成員L1啟動子 |
丘腦中星形膠質細胞特異性啟動子 |
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MBP |
1.3kb |
人源 |
髓磷脂堿性蛋白啟動子 |
少突膠質細胞特異性啟動子 |
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肝臟 |
ALB |
2.4kb |
小鼠 |
白蛋白啟動子 |
肝臟特異性啟動子 |
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TBG |
681bp |
人源 |
甲狀腺素結合球蛋白啟動子 |
肝臟特異性啟動子 |
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ApoEHCR-hAAT |
1.3kb |
人源 |
載脂蛋白E的肝細胞控制區和人α1抗胰蛋白酶啟動子的嵌合啟動子 |
肝臟特異性啟動子 |
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心臟 |
aMHC |
0.4kb |
小鼠 |
肌球蛋白重鏈α啟動子 |
心臟特異性啟動子 |
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cTNT+intron |
0.7kb |
雞 |
心肌肌鈣蛋白T啟動子 |
心肌特異性啟動子 |
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眼睛 |
Rpe65 |
0.7kb |
小鼠 |
視網膜色素上皮65啟動子 |
視網膜色素上皮細胞特異性啟動子 |
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VMD2 promoter |
0.65bp |
人源 |
卵黃形成黃斑性營養不良2基因啟動子 |
視網膜色素上皮細胞特異性啟動子 |
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胰腺 |
Insulin receptor |
0.85kb |
小鼠 |
胰島素基因啟動子 |
胰腺β細胞特異性啟動子 |
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PDX1 |
2.7kb |
小鼠 |
胰十二指腸同源盒1啟動子 |
胰腺β細胞特異性啟動子 |
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血管 |
SM22a |
0.45kb |
小鼠 |
SM22α啟動子 |
血管平滑肌特異性啟動子 |
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ICAM2 |
0.15kb |
人源 |
細胞間粘附分子2啟動子 |
血管內皮特異性啟動子 |
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CD68 |
0.7kb |
人源 |
CD68分子啟動子 |
單核巨噬細胞特異性啟動子 |
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F4/80 |
1.2kb |
小鼠 |
F4/80基因promoter |
巨噬細胞特異性啟動子 |
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肌肉 |
MCK |
1.3kb |
小鼠 |
肌酸激酶基因啟動子 |
肌肉細胞特異性啟動子 |
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3×enhancer McK |
728bp |
小鼠 |
修改的肌酸激酶基因啟動子 |
肌肉細胞特異性啟動子 |
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腎臟 |
NPHS1 |
1.2kb |
小鼠 |
Nephrin 1基因啟動子 |
腎臟特異性啟動子 |
Step 3：插入ORF片段
維真擁有超過維真擁有超過18000余個人源ORF的現貨克隆庫，可以通過簡單的“剪切粘貼”穿梭到我們的病毒載體中。如果您想從我們的人源ORF庫中選擇，只需提供相應的產品編號、基因名稱或基因編號。如果您想定制，我們還提供分子克隆和定點突變服務。此外，您也可以提供自己的序列，我們將其克隆到相應的載體中。
Step 4：選擇合適的標簽
維真提供各種標簽、報告基因和誘導系統，可用于在 AAV克隆、腺病毒克隆或慢病毒克隆期間自定義我們的病毒載體。
Step 5：病毒包裝
如果您選擇的是病毒載體，后續有病毒包裝的需求，那么我們可以直接將構建好的自定義載體包裝成病毒顆粒。請訪問病毒包裝頁面，了解更多有關慢病毒、腺病毒和腺相關病毒包裝的相關資料。
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1. 如果我不知道序列兩端的酶切位點，也不知道載體的圖譜，但可以提供基因序列和測序引物的序列，你們是否可以承接這個項目？
可以，但是我們在克隆之前需要測序驗證酶切位點附近的序列。
2. 我們能夠提供細菌培養物作為亞克隆的原材料嗎？
不推薦，因為細菌培養物不如DNA穩定，但是如果細菌培養物是唯一的選擇，我們也可以嘗試去做。
3. 模板是維真生物之前合成的，你們依然有質粒備份嗎，還是需要我們再次提供？
我們通常會保留質粒備份1年。如果先前的訂單已完成1年多，但是不超過5年，我們可能還有備份，但是需要跟生產部門核實。
4. 我們有引物，需要我們提供還是你們自己設計并合成？
我們將自己設計并合成用于克隆的引物，您只需要提供我們模板，并讓我們知道您最終想得到的基因序列。
5. 我有復雜的克隆方案，我需要設計克隆方案嗎？
您只要提供給我們模板序列、模板載體和目的序列、目的載體，我們的生產小組將會設計最優的克隆方案。
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1. |
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2. |
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3. |
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4. |
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5. |
400-077-2566
service@wzbio.cn
