CRISPR/Cas9是繼鋅指核酸酶(ZFN)和轉錄激活因子樣效應物核酸酶(TALEN)以來的第3代基因編輯技術。該技術自2013年迎來了高速發展時代。它利用含有與靶基因同源的sgRNA與Cas9共同作用切割靶基因。在基因敲除實驗中，由于gRNA所介導的基因敲除效率難以預料，因此，高效gRNA的選擇對于成功敲除基因是非常關鍵的。為了提高切割效率，科研工作者通常會設計3-5條gRNA，并篩選高效gRNA。無論是特異gRNA敲除效果的檢測，還是高效gRNA的篩選，科研工作者均需要通過生物實驗手段來驗證。維真生物可根據您的實驗需求提供個性化的基因敲除效果檢測服務。
維真生物可采取多種方法幫客戶檢測特異gRNA敲除效果和篩選高效gRNA，具體信息詳見下表：
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服務編號 |
服務類型 |
規格 |
目錄價 |
貨期 |
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WZ100001-1 |
特異gRNA沉默效果檢測 |
熒光檢測 推薦！ 直接克隆測序 |
詢價 |
咨詢 |
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WZ100001-2 |
特異gRNA沉默效果檢測 |
PCR產物測序 |
詢價 |
咨詢 |
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WZ100002-1 |
高效gRNA篩選 |
熒光檢測 推薦！ 直接克隆測序 |
詢價 |
咨詢 |
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WZ100002-2 |
高效gRNA篩選 |
PCR產物測序 |
詢價 |
咨詢 |
*如您對上述服務感興趣，請您點擊“歡迎垂詢”留下您的信息，我們將為您提供具體實驗方案和項目價格。
相關服務： CRISPR-Cas9克隆 腺病毒包裝 慢病毒包裝 腺相關病毒包裝 KO細胞系建立
敲除效果的常規檢測方法是PCR產物測序的定性法和直接克隆測序的定量法。這兩種方法受細胞類型的限制，它們是在基因組水平進行測量，故結果真實度比較高。盡管如此，它們在操作、實驗周期和檢測細胞類型方面就顯得遜色。為了克服這些問題，維真生物建立了一套簡捷和可重復的基因敲除效果檢測系統——熒光法。
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優勢 |
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1. 操作簡單； 2. 周期短，通常3個工作日即可完成； 3. 敲除效果檢測不受細胞類型的限制；
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4. 敲除效果直觀、明了，通過EGFP是否發光檢測敲除效果的發生；通過EGFP的發光強度定性敲除效率； 5. 實驗結果可靠、重復性好。 |
下圖是根據某基因設計多條gRNA序列，將pKO-Reporter和gRNA、Cas9質粒共轉染HEK293，48h后觀察的熒光結果：
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PCR產物測序、直接克隆測序和熒光法的比較
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檢測方法 |
周期 |
定性/定量 |
真實度 |
細胞類型受限性 |
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PCR產物測序 |
較短，4-5個工作日 |
定性，根據套峰情況判斷敲除效果和效率 |
好，基因組位點切割 |
受限制 |
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直接克隆測序 |
長，10-15個工作日 |
定量，可計算敲除效率 |
好，基因組位點切割 |
受限制 |
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熒光法 |
短，3個工作日 |
定性，根據熒光情況判斷敲除效果和效率 |
較好，切割位點在外源質粒 |
不受限制 |
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TALEN
Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs) 轉錄激活樣效應因子核酸酶是具有序列特異性的限制性內切酶，通過融合類轉錄激活因子效應物（TALE）的DNA結合結構域實現DNA雙鏈的斷裂，借助宿主細胞DNA修復機制，通過同源重組或非同源性末端連接 (NHEJ)進行DNA修復，從而產生Indel基因編輯效果。其作用原理見下圖：
TALE(TAL effectors，類激活因子效應物)：
TALE是植物病原菌黃單胞菌(Xanthomonas)自然分泌的蛋白，能夠識別特異性DNA堿基對。
設計策略：
應用示例——腺相關病毒在人源基因組中整合位點AAVS1的基因編輯
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比較項 |
TALEN |
CRISPR-CAS9 |
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識別靶序列模式 |
Protein-DNA |
RNA-DNA |
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匹配靶序列模塊 |
一個RVD(重復可變雙殘基)識別單個堿基 |
RNA-DNA堿基互補配對 |
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靶序列堿基數 |
>16bp *2 |
~20bp |
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脫靶率 |
低 |
有潛在脫靶性 |
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多個基因同時敲除 |
不可以 |
可以 |
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甲基化敏感 |
敏感 |
不敏感 |
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適用物種 |
廣泛 |
廣泛 |
400-077-2566
service@wzbio.cn
