熒光素酶（luciferase）是自然界中能夠產生生物熒光的酶的統稱，可以催化熒光素氧化成氧化熒光素，在氧化過程中發出生物熒光。熒光素酶以出色的靈敏度、使用方便、可定量檢測成為理想的報告基因。熒光素酶的種類很多，其中應用較為廣泛的是螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase，FLUC）和海腎熒光素酶（Renilla luciferase，RLUC）。
■ 螢火蟲熒光素酶是一個61kD的單體酶，不需要表達后修飾即可獲得酶活性，其催化的發光反應必須要有ATP和熒光素的參與，在ATP、Mg2+和O2存在的條件下，熒光素在熒光素酶的催化下氧化產生黃綠光，波長540-600nm。
■ 海腎熒光素酶是一個36kD的單體酶，同樣不需要表達后修飾即可產生酶活性，只需要O2即可催化腔腸素氧化發出藍光，波長460-540nm。
由于螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的催化底物和發光顏色不同，且光吸收波長不同，可在互不干擾的情況下進行檢測，此外，在哺乳動物體內兩種酶均無內源性表達，因此作為雙熒光素酶報告基因系統得到廣泛使用。在雙熒光素酶檢測中，通常以螢火蟲熒光素酶為實驗報告基因，以海腎熒光素酶為對照報告基因，以減少細胞活性、轉染效率等外在變化因素對實驗準確性的影響。
將螢火蟲熒光素酶報告基因質粒與帶有海腎熒光素酶基因的質粒共轉染細胞，或者將兩種報告基因構建到同一載體上，用不同的啟動子啟動其表達，通過計算螢火蟲熒光素酶檢測值與海腎熒光素酶檢測值的比值（Firefly Luciferase/ Renilla Luciferase），分析熒光素酶的表達水平。
雙熒光素酶報告基因系統憑借靈敏度高、檢測范圍廣、方便快速的優勢，已成為基因轉錄調控、啟動子結構分析、啟動子SNP分析和非編碼RNA靶向互作等研究的重要手段。
將靶啟動子片段插入到螢火蟲熒光素酶表達序列上游，構建實驗報告基因質粒，將要檢測的轉錄因子表達質粒與兩種報告基因質粒共轉染相關細胞；經細胞培養后裂解細胞，離心取上清，隨后分別加入兩種熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應產生熒光，通過檢測熒光的強度測定熒光素酶的活性，從而判斷轉錄因子是否與該啟動子存在相互作用。
備注：如果轉錄因子能夠激活靶啟動子，則螢火蟲熒光素酶基因就會表達，且螢火蟲熒光素酶的表達水平與轉錄因子的作用強度成正比。
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miRNA通過識別mRNA的3’UTR區，誘導細胞內沉默復合體介導的mRNA降解或抑制mRNA的翻譯過程。將野生型或突變型待測靶基因的3’UTR序列構建至螢火蟲熒光素酶基因的3’端，將兩個報告基因質粒與miRNA在細胞內共表達，通過比較螢火蟲熒光素酶報告基因表達活性的改變，驗證miRNA對靶基因的調控作用。
備注：若螢光素酶的活性降低，提示miRNA可能參與抑制靶基因的表達。
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